编辑推荐：
本文聚焦组蛋白（histones）与抗菌肽（AMPs），发现二者协同可在细菌膜上形成 26nm 大孔，显著增强抗菌效果。这一机制为理解先天免疫提供依据，有望开发新型抗生素策略，对抗日益严重的耐药问题。
研究背景
组蛋白作为真核生物的蛋白质，80 多年前就被发现具有抗菌作用，但之后更多地被研究其在染色体 DNA 浓缩和转录调控方面的功能。在哺乳动物先天免疫中，组蛋白与抗菌肽（AMPs）共定位，参与中性粒细胞胞外陷阱（NETs）和脂滴相关过程 。不过，组蛋白与 AMPs 协同抗菌的机制以及组蛋白形成膜孔的情况尚不明确。
AMPs 如人源 LL-37、细菌源多粘菌素 B（PMB）和 E（粘菌素）等可在革兰氏阴性菌外膜形成孔道。LL-37 形成环形孔道，PMB 和粘菌素则靶向脂多糖（LPS）并使其重排为刚性晶体结构。组蛋白 H2A 能增加 LL-37 进入细菌细胞质，但具体机制未知。而且，组蛋白在生理离子浓度下活性较低，单独作用时似乎无法启动膜孔形成，其在低离子条件下虽有抗菌活性，但如何穿过细菌内膜进入细胞质也不清楚。本研究以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠杆菌（Escherichia coli）为对象，探究组蛋白 H2A 的成孔活性。
研究结果
- 组蛋白 H2A 增强 PMB 的抗菌活性：体外实验中，用亚最小抑菌浓度（MICs）的 PMB（0.5μg/mL，3.2μM）、组蛋白 H2A（10μg/mL，0.7μM）单独或联合处理大肠杆菌 1 小时后，发现单独处理时，PMB 或 H2A 仅适度降低菌落形成单位（CFUs），而联合处理使 CFUs 降低超 7 个数量级，且在液体培养中完全抑制细菌生长，其抗菌效果强于卡那霉素、庆大霉素和四环素 。对铜绿假单胞菌的实验结果类似，联合处理可使 CFUs 降低超 5 个数量级，抑制生长达 15 小时，棋盘法检测显示二者联合的分数抑菌浓度（FIC）指数分别为 0.16 和 0.19，表明具有强协同作用。
体内实验中，在蜡蛾幼虫感染模型中，感染铜绿假单胞菌后，单独注射 H2A 或磷酸盐缓冲盐水（PBS）的幼虫 24 小时后全部死亡，单独注射 PMB 使 22% 的幼虫存活至 24 小时，而联合注射 PMB 和 H2A 的幼虫至少存活 5 天，与庆大霉素处理组相当。在小鼠角膜感染模型中，感染铜绿假单胞菌后，单独用 H2A 或 PMB 处理的小鼠角膜混浊程度与未处理组无显著差异，而联合处理组角膜疾病明显减轻，细菌数量显著减少，效果与庆大霉素处理组相似 。
2. H2A 与 PMB 联合导致细菌外膜和内膜形成孔道：利用低温透射电子显微镜（cryoEM）观察细菌膜结构，发现联合处理 30 分钟后，铜绿假单胞菌外膜出现明显破坏，每个细胞外膜最多可检测到 7 个平均直径 22.1nm 的孔，大肠杆菌外膜最多有 15 个平均直径 25.8nm 的孔，且部分孔贯穿外膜和内膜 。而未处理细胞或单独用 H2A、PMB 处理的细胞未观察到孔或明显膜变形。常规透射电子显微镜（TEM）检测结果也支持联合处理可导致膜孔形成。
3. 孔道增加分子运输和 H2A 定位：用碘化丙啶（PI）、荧光标记的葡聚糖和荧光标记的 H2A 检测膜通透性。结果显示，PMB 单独处理可增加大肠杆菌细胞质中 PI 荧光，表明其增加了外膜和内膜的通透性；H2A 单独处理无此效果，但二者联合使 PI 荧光增加 16 倍 。对于 150kDa 的荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记葡聚糖，PMB 单独处理使其摄取增加 3 倍，联合处理增加 8 倍，表明联合处理显著增加了孔的大小和数量。
通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）跟踪荧光 H2A（AF647-H2A）的单分子定位，发现单独用 AF647-H2A 处理时，其主要结合在外膜；加入 PMB 后，AF647-H2A 计数显著增加，多数形成直径小于 50nm 的簇，平均直径为 18.7nm，且直径大于 110nm 的簇出现频率更高，说明 PMB 增加了 H2A 在细胞上的定位并促进其形成大簇 。
4. H2A 可透化内膜小叶和外膜的内膜小叶：用大肠杆菌原生质球评估 H2A 对内膜外小叶的成孔活性，发现 H2A 单独处理可使原生质球破裂，诱导快速 PI 摄取和膜通透性增加，而 PMB 单独处理在实验浓度下对 PI 摄取影响不显著 。将荧光 H2A（AF488-H2A）通过电穿孔导入大肠杆菌细胞质，发现细胞质中 AF488-H2A 荧光增加的同时，PI 摄取显著增加 23 倍，表明 H2A 从细胞内显著增加了内膜和外膜的通透性。
5. 脂多糖抑制 H2A 在外膜的成孔活性：在革兰氏阴性菌中，LPS 主要存在于外膜外小叶。研究发现，LPS 缺陷的大肠杆菌 ΔwaaC突变体对 H2A 的摄取显著增加，PI 荧光也略有增加，而野生型细胞无此现象。H2A 处理 ΔwaaC突变体可延迟其指数生长，高浓度时完全抑制生长，而对野生型菌株生长影响较小，表明 LPS 抑制了 H2A 的膜透化活性和生长抑制作用 。
6. 抗菌协同作用源于对膜的正交活性：基于实验结果提出 AMPs 与组蛋白协同作用模型，即 AMPs 透化外膜，使 AMPs 和组蛋白进入周质空间，组蛋白进而透化外膜内膜小叶和内膜外小叶 。通过理论模型模拟发现，当组蛋白和 AMPs 的活性正交时，协同作用增强，当组蛋白对 LPS 表面活性低、对非 LPS 表面活性高时，协同作用最大，PMB 与 H2A 的组合接近协同峰值 。
评估 H2A 与 LL-37 的协同作用，发现二者联合处理大肠杆菌产生的 FIC 指数为 0.27，使细菌活力降低 3 个数量级，抑制细菌生长时间比 LL-37 单独处理长 5 小时，产生 17.0nm 的圆形膜变形，H2A 形成平均直径 19.5nm 的簇，部分直径≥110nm，表明 LL-37 与 H2A 的协同机制与 PMB 类似 。在 ΔwaaC突变体中，PMB 与 H2A 对其外膜外小叶的活性重叠，协同作用消失，FIC 指数为 0.63，表现为相加作用而非协同作用。
讨论
本研究表明组蛋白 H2A 可透化除含有 LPS 的外膜外小叶之外的所有膜表面，单独的组蛋白比 AMPs 具有更强的成孔活性，生理离子条件下组蛋白活性受 LPS 抑制 。AMPs 与组蛋白的组合通过在所有膜表面形成孔道，构成一种强大的抗菌机制。PMB 与 H2A 形成的 26nm 孔道比其他 AMPs 形成的孔道大得多，可能是 PMB 形成的小孔使 H2A 进入周质空间，进而在内部膜上形成大孔 。
协同抗生素组合研究意义重大，本研究为 AMPs 与组蛋白的协同作用提供了机制解释，即源于对 LPS 和非 LPS 膜的正交靶向 。虽然 LL-37 与 H2A 的协同指数和杀菌活性低于 PMB 与 H2A 组合，但二者都符合正交膜靶向模型。组蛋白除形成膜孔外，还可重组细菌基因组 DNA，抑制转录和复制，AMPs 与组蛋白的组合可从多个方面攻击细菌 。
PMB 与 H2A 的协同抗菌活性在临床治疗革兰氏阴性菌感染中可能有效，使用组蛋白或类似作用分子与多粘菌素联合，可提高抗生素疗效，降低多粘菌素浓度，减少其神经毒性和肾毒性 。此外，其他 AMPs 与组蛋白也可能存在类似协同作用，正交靶向有望成为有效抗菌策略，减缓抗生素耐药危机。
研究局限性
本研究仅针对全长组蛋白 H2A 与 PMB、LL-37 的协同作用，H2A 的 N 端虽有成孔活性，但不确定其单独是否足以产生协同效应，其他组蛋白（H1、H2B、H3 和 H4）及组蛋白衍生肽与 PMB 或其他 AMPs 是否存在协同作用也有待研究 。本研究仅在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中观察到抗菌效果，革兰氏阴性菌的 LPS 结构和膜性质多样，需进一步研究 H2A 与 PMB 的协同效应是否适用于其他革兰氏阴性菌 。在革兰氏阳性菌中，细胞壁生理结构不同，可能限制 H2A 与 PMB 的协同作用，其协同情况也需进一步探究 。
