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本文聚焦去泛素化酶 OTUD4 在肿瘤铁死亡（ferroptosis）中的作用。研究发现，OTUD4 通过稳定 GPX4 和抑制自噬性降解来抑制铁死亡，促进肿瘤进展。靶向 OTUD4 联合铁死亡诱导剂有显著抗肿瘤效果，为癌症治疗提供新思路。
研究背景
铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁代谢和脂质过氧化的调节性细胞死亡方式，在肿瘤治疗领域备受关注。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）是铁死亡的主要负调节因子，其功能或稳定性受损会引发铁死亡。去泛素化酶（DUBs）参与细胞内蛋白质稳定性和信号调节，但 DUBs 在铁死亡调控中的作用尚未完全明晰。OTU 去泛素化酶 4（OTUD4）作为一种特定的 DUB，在细胞周期调控、DNA 修复、免疫调节和肿瘤发生等过程中发挥作用，然而其在铁死亡中的具体功能尚不明确。此外，自噬与铁死亡之间的复杂相互作用也是当前研究的热点，GTP 结合蛋白 Rheb（RHEB）可通过调节 mTORC1 影响自噬，间接调控蛋白质的自噬性降解。本研究旨在阐明 OTUD4 影响铁死亡的分子机制，探索其作为治疗靶点的临床潜力。
研究结果
- OTUD4 在肿瘤中的表达及预后意义：通过对多个癌症数据库的分析发现，OTUD4 在多种肿瘤类型中显著上调，如结直肠癌（COAD）、食管癌（ESCA）、胃癌（STAD）和头颈部鳞状细胞癌（HNSC）等。与正常组织相比，肿瘤组织中 OTUD4 的转录水平和蛋白表达均明显升高。Kaplan - Meier 生存分析显示，OTUD4 高表达的患者总体生存率较低，表明其与不良预后相关，提示 OTUD4 可能作为癌症预后标志物和治疗靶点。
- OTUD4 缺失增强铁死亡并抑制肿瘤生长：利用 CRISPR - Cas9 技术构建 OTUD4 缺陷型细胞系，发现这些细胞对铁死亡诱导剂（如 erastin 和 RSL3）更为敏感，细胞死亡加速，铁死亡特征性指标如脂质过氧化（LPO）和活性氧（ROS）水平显著升高。在小鼠异种移植模型中，OTUD4 缺失的细胞联合 erastin 处理后，肿瘤体积和重量明显减小，且对小鼠体重无显著影响。组织学评估表明，OTUD4 缺失增强了 erastin 的致死效应，抑制细胞增殖，促进细胞死亡，同时降低了 GPX4 的表达，增加了 4 - HNE 染色（LPO 和铁死亡的标志）。使用 OTUD4 的突变体（C45A）进一步证实，靶向 OTUD4 可促进铁死亡，抑制肿瘤增殖。
- OTUD4 通过与 GPX4 相互作用及去泛素化调节肿瘤铁死亡：通过质谱分析、共免疫沉淀（coIP）和共聚焦显微镜实验，证实 OTUD4 与 GPX4 存在相互作用且共定位于细胞质中。OTUD4 过表达可剂量依赖性地增加 GPX4 蛋白水平，而 OTUD4 敲除则导致 GPX4 表达降低，这种降低可被蛋白酶体抑制剂 MG132 部分逆转，表明 OTUD4 通过抑制 GPX4 的泛素化来维持其稳定性。CHX chase 实验显示，OTUD4 缺失加速 GPX4 降解。泛素化实验表明，OTUD4 可降低 GPX4 的泛素化水平，且主要去除 K48 - 连接的泛素链。功能实验表明，OTUD4 敲除增强了 erastin 诱导的铁死亡，而 HA - GPX4 过表达可部分逆转这一效应，说明 OTUD4 通过结合并去泛素化 GPX4，抑制肿瘤细胞铁死亡。
- OTUD4 缺失增强肿瘤铁死亡部分依赖自噬：研究发现，OTUD4 缺失的细胞对 erastin 诱导的铁死亡更为敏感，这种敏感性可被铁死亡抑制剂 Ferrostatin - 1（Fer - 1）部分抑制。使用凋亡抑制剂 Z - VAD - FMK（Z - VAD）、坏死抑制剂 necrosulfonamide（NSA）和自噬抑制剂 3 - Methyladenine（3 - MA）处理细胞，结果显示只有 3 - MA 能显著缓解 erastin 导致的细胞活力下降，表明铁死亡部分依赖自噬过程。通过 GFP - mCherry - LC3B 报告基因和自噬标志物检测发现，OTUD4 缺失细胞的自噬活性增强。体内实验也证实，3 - MA 可部分抵消 erastin 对 OTUD4 缺失组肿瘤生长的抑制作用，说明 OTUD4 缺失通过激活自噬途径增强肿瘤细胞对铁死亡的敏感性。
- OTUD4 通过 RHEB 介导的自噬性降解 GPX4 增强肿瘤细胞对铁死亡的抗性：蛋白质组学分析发现 RHEB 与 OTUD4 相互作用，内源性和外源性 coIP 实验及共聚焦显微镜观察证实了这一相互作用。OTUD4 过表达可显著增加 RHEB 蛋白水平，而 OTUD4 缺失则导致 RHEB 蛋白水平下降，且这种下降可被 MG132 部分逆转，表明 OTUD4 通过减少 RHEB 的泛素化来抑制其降解。泛素化实验表明，OTUD4 主要去除 RHEB 的 K48 - 连接的泛素链。使用 RHEB 构建体或抑制剂实验证实，OTUD4 通过调节 RHEB 稳定性来调控 GPX4 的自噬性降解。动物实验表明，OTUD4 缺失加速 erastin 诱导的铁死亡，而 GPX4 和 RHEB 均可部分逆转这一效应，说明 OTUD4 不仅通过去泛素化稳定 GPX4，还通过 RHEB 介导的自噬途径调控 GPX4 的降解，增强肿瘤细胞对铁死亡的抗性。
- OTUD4 作为肿瘤铁死亡的潜在治疗靶点：铁死亡诱导剂在临床应用中存在安全性和特异性问题。Regorafenib 是一种激酶抑制剂，可诱导铁死亡并增强抗癌疗效。代谢组学分析显示，regorafenib 处理可调节肿瘤细胞中的谷胱甘肽（GSH）途径，降低 GSH 水平，诱导铁死亡。OTUD4 敲除联合 regorafenib 处理可显著抑制肿瘤细胞生长，降低 GPX4 蛋白表达，增强铁死亡效应。在小鼠皮下肿瘤模型中，口服 regorafenib 联合 OTUD4 缺失可显著抑制肿瘤增殖，表明靶向 OTUD4 联合 regorafenib 具有卓越的抗肿瘤疗效，为临床应用提供了新策略。
研究讨论
本研究明确了 OTUD4 在癌细胞铁死亡调控中的关键作用，其通过对 GPX4 去泛素化和调节自噬两条途径共同抑制铁死亡。OTUD4 缺失可增强肿瘤细胞对铁死亡诱导剂的敏感性，抑制肿瘤生长。从机制上看，OTUD4 通过去除 GPX4 的 K48 - 连接的泛素链，稳定 GPX4，减少 LPO 和 ROS 积累；同时，OTUD4 通过去泛素化 RHEB，抑制自噬，减缓 GPX4 的自噬性降解，进一步抑制铁死亡。这一发现拓展了对铁死亡调控网络的认识，为以去泛素化为中心的抗癌策略提供了理论基础。
此外，本研究还揭示了 OTUD4 在调节自噬与铁死亡相互作用中的重要功能。以往研究对自噬在铁死亡中的作用存在争议，本研究证实 RHEB 参与了这一调节过程，OTUD4 通过调节 RHEB - 自噬 - GPX4 轴，丰富了对自噬与铁死亡关系的理解。与其他仅在单一调节途径中发挥作用的泛素酶不同，OTUD4 可协调多条途径调节铁死亡，为 DUBs 在铁死亡研究领域提供了新视角。
在临床应用方面，靶向 OTUD4 联合铁死亡诱导剂展现出巨大潜力。CRISPR - Cas9 介导的 OTUD4 敲除实验表明，肿瘤细胞对铁死亡诱导剂的敏感性增强，体内实验也证实了 OTUD4 敲除可显著抑制肿瘤生长。Regorafenib 与 OTUD4 敲除联合使用具有显著的协同抗肿瘤效应，且 regorafenib 可调节肿瘤细胞的 GSH 途径，诱导铁死亡。靶向抑制 OTUD4 可通过双重调节机制加速 GPX4 分解代谢，增强铁死亡效应，抑制肿瘤增殖，有望克服肿瘤对化疗药物的耐药性，为癌症治疗开辟新途径。
研究局限性
本研究主要基于结直肠癌和肺癌细胞系以及相对较小的患者队列，可能限制了研究结果向更广泛人群和不同肿瘤亚型的推广。此外，缺乏选择性的 OTUD4 药理学抑制剂，使得机制研究主要依赖基因调控手段。同时，临床验证的 regorafenib 耐药肿瘤标本有限，限制了全面的临床相关性分析。未来需通过扩大患者队列、开发先进的药理学策略和增加临床样本验证等方法，提高研究结果的可靠性和临床转化价值。
