编辑推荐：
为解决牛津纳米孔技术（ONT）不同化学检测在 DNA 甲基化研究中的一致性和偏差问题，研究人员对 R9.4.1 和 R10.4.1 化学检测数据进行研究。结果显示二者数据一致性高，R10 在重复区域检测更可靠，但都有偏差。该研究为相关分析提供了重要参考。
在生命科学领域，DNA 甲基化作为一种关键的表观遗传机制，如同给基因加上了 “特殊标记”。它通过在核苷酸碱基上添加甲基基团，却不改变 DNA 序列，在众多生物过程中发挥着不可或缺的作用。比如在基因沉默方面，它能像一把 “锁”，让某些基因暂时 “安静” 下来；在维护基因组稳定性上，它如同忠诚的 “卫士”，守护着基因的稳定。然而，一旦 DNA 甲基化水平出现异常，就可能引发各种人类疾病，像肿瘤、自身免疫性疾病等。
为了精准探究 DNA 甲基化在生物过程和疾病中的作用，准确检测 DNA 甲基化至关重要。目前已有多种检测方法，如甲基化微阵列，它能检测特定已知位点的 5 - 甲基胞嘧啶（5mC），但检测位点有限；亚硫酸氢盐测序和其他短读长测序，难以在占人类基因组约一半的重复区域可靠检测甲基化。相比之下，牛津纳米孔技术（ONT）和 PacBio SMRT 测序作为长读长测序技术，为解决重复区域甲基化检测难题带来希望，其中 ONT 测序成本更低，更具优势。
ONT 主要有 R10.4.1 和 R9.4.1 两种化学检测技术。R9.4.1 曾被广泛应用，产生了大量数据，推动了甲基化检测工具的发展；R10.4.1 于 2023 年推出，其每个纳米孔配备两个传感器，旨在提高碱基识别准确性。随着 R9.4.1 逐渐停用，R10.4.1 开始大量产出数据，对两种技术数据进行交叉分析变得必要。但此前很少有研究直接探究它们在甲基化数据上的一致性和潜在偏差，使得 ONT 甲基化研究面临挑战。
为了填补这一空白，美国内华达大学拉斯维加斯分校（University of Nevada, Las Vegas）的研究人员 Raj Doshi、Evan Kinnear 等人开展了相关研究。他们选用人类结肠肿瘤细胞系 HCT116 的野生型（WT）和敲除肌醇多磷酸多激酶（IPMK）的敲除型（KO）细胞，分别用 R9.4.1 和 R10.4.1 化学技术进行测序。研究发现，虽然两种技术产生的甲基化数据一致性较高，且 R10 化学技术在重复区域的甲基化检测上更可靠，但二者都存在检测偏差。在差异分析中，交叉化学分析会受到化学技术偏差的影响，检测出大量因化学技术差异而非实验敲除导致的甲基化差异位点。此外，研究人员还比较了不同计算覆盖度和甲基化百分比的方法，发现基于 modbam2bed 输出结果的 method - 1 计算方法更适合甲基化研究。
这项研究意义重大，它为研究人员在进行 ONT 甲基化分析时提供了宝贵的建议，有助于避免因化学技术差异导致的假阳性分析结果，为后续更准确地研究 DNA 甲基化在生物过程和疾病中的作用奠定了基础。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先，通过 CRISPR/Cas9 技术构建 HCT116 细胞的 IPMK 基因敲除模型；然后，分别从 WT 和 KO 细胞中提取 DNA，进行 ONT 文库制备和测序，其中 R9.4.1 和 R10.4.1 化学技术在文库制备和测序上有不同的 DNA 用量和操作细节；测序后，利用 ONT 的 Dorado basecaller 进行碱基识别，minimap2 进行序列比对，modbam2bed 对甲基化数据进行总结分析。
下面来详细看看研究结果：
- ONT 测序数据总结：研究人员培养了两对 HCT116 WT 和 KO 细胞，提取 DNA 后用 R9.4.1 或 R10.4.1 flowcells 进行测序，每个样本测序深度均大于 30X。测序数据经过碱基识别、比对和过滤后，对甲基化数据进行总结，并测试不同计算覆盖度和甲基化百分比的方法。
- R9.4.1 和 R10.4.1 flowcells 甲基化检测的一致性分析：研究人员通过与亚硫酸氢盐测序数据对比，发现纳米孔甲基化数据可靠性高，且 R10 - Nanopore 甲基化数据相关性更高。对 WT 和 KO 样本不同重复测序结果的分析显示，R9 和 R10 化学技术产生的甲基化数据相关性高，甲基化差异较小的位点比例大，不一致率低，表明两种技术在甲基化检测上一致性良好。
- R9.4.1 和 R10.4.1 flowcells 化学偏向性甲基化检测：对比不同化学技术的 WT 和 KO 样本甲基化数据发现，跨化学技术比较时相关性较低，说明化学技术差异会影响甲基化差异分析。研究还发现少量甲基化位点在 R9 和 R10 化学技术检测中有较大差异，R10 化学技术在检测重复区域甲基化水平上表现更优。
- 化学偏向性甲基化对差异分析的影响：研究人员进行了三组差异分析，发现交叉条件和交叉化学分析检测出大量因化学技术差异导致的甲基化模式，交叉化学分析检测出的差异甲基化位点（DMPs）大部分能在交叉条件和交叉化学分析中找到，这表明在进行交叉化学差异甲基化分析时，需要关注化学技术偏向性的影响。
- 不同计算覆盖度和甲基化百分比方法的影响：研究人员比较了 modbam2bed - calculation、method - 1 calculation 和 method - 2 calculation 三种计算方法，发现 method - 1 calculation 在样本重复对的相关性计算中表现更合理，而 method - 2 calculation 相关性较低，不适合实际应用。
研究结论和讨论部分指出，ONT 测序在甲基化研究中应用广泛，虽然 R10 和 R9 化学技术在甲基化检测上都存在偏差，但二者数据一致性高，R10 化学技术在重复区域检测更可靠。研究人员确定了基于 modbam2bed 输出结果进行甲基化研究的更优计算方法，为后续 ONT 甲基化数据的交叉化学分析提供了可行的实践方案，有助于减少因化学技术差异导致的假阳性甲基化差异，推动 DNA 甲基化研究的发展。
