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在生物分子研究中，定向进化意义重大，但现有哺乳动物定向进化系统问题重重。为破难题，研究人员开展 PROTein Evolution Using Selection（PROTEUS）平台研究。结果显示该平台稳定高效，能优化分子工具。这为在哺乳动物细胞中进化生物分子提供新途径。
在生命科学的探索旅程中，生物分子的定向进化一直是科研人员关注的焦点。定向进化就像是一场精心策划的 “分子育种”，通过突变和人工选择，培育出具有新功能或更优活性的生物分子，在药物研发、疾病治疗等诸多领域都有着巨大的潜力。然而，目前的定向进化平台大多基于原核生物或酵母，这些简单系统缺乏哺乳动物细胞中复杂的翻译后修饰、蛋白质 - 蛋白质相互作用以及信号网络。理想情况下，用于哺乳动物的蛋白质应在哺乳动物细胞中直接进化，但历史上常用的体外诱变技术结合哺乳动物细胞表型筛选，以及近期的靶向诱变技术，都存在一些问题，比如宿主基因组突变会干扰细胞内基于靶点分子与细胞适应性关联的研究。现有的基于病毒的哺乳动物定向进化系统也受到安全性、突变率低、靶点特异性以及功能缺失等限制 。
为了突破这些困境，来自澳大利亚悉尼大学（The University of Sydney）的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了关于 PROTein Evolution Using Selection（PROTEUS）平台的研究，最终发现该平台能够利用嵌合病毒样囊泡（VLVs）实现哺乳动物细胞的定向进化，且不会破坏系统完整性，这一成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：首先是细胞培养技术，培养了 BHK - 21 细胞和 HEK293T 细胞等；其次是分子生物学和质粒构建技术，构建了 PROTEUS 系统和各种合成电路质粒；然后是病毒样囊泡（VLV）相关技术，包括 VLV 的包装、滴定、转导等；还有基因编辑技术，如构建 CRISPR 敲除细胞系；以及多种检测分析技术，像荧光素酶 / 刃天青检测、测序技术（长读长纳米孔测序、短读长 Illumina 测序等）用于分析基因变异 。
研究结果
- VLVs 的宿主依赖性繁殖：研究人员设计了基于塞姆利基森林病毒（SFV）复制子的嵌合双组分系统，该系统中 SFV VLVs 的感染性取决于宿主细胞中印第安纳水泡性口炎病毒 G（VSVG）包膜蛋白的表达水平。实验表明，VLVs 的繁殖依赖宿主细胞表达的 VSVG，且在传播过程中会积累真实的突变，突变类型多样，存在 A - G（和互补的 U - C）转换突变偏好，这与 ADAR 依赖性突变一致 。
- PROTEUS 生成真实的进化产物：通过四环素调控反式激活因子（tTA）的实验，研究人员进行了两轮独立的十轮进化筛选，成功分离出对强力霉素（dox）耐药的 tTA 变体，验证了 PROTEUS 平台能生成真实的进化产物 。
- 增强药物诱导的转录控制：研究人员利用 PROTEUS 平台优化第三代反向四环素调控反式激活因子（rtTA - 3G），经过 30 轮的进化，获得了 M59I 和 D5N 突变体，这些突变体增强了 rtTA - 3G 对 dox 的敏感性，且在人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类胚体实验中表现出良好的效果，有望成为第四代 rtTA 工具（rtTA - 4G） 。
- 细胞内纳米抗体的定向进化：针对 p53 生物传感器纳米抗体 Nb139 存在的问题，研究人员使用 PROTEUS 平台进行定向进化，获得了 S26P 和 Y60C 突变体，其中 S26P 单突变体对顺铂处理后的 p53 核定位响应最佳，改进了 Nb139 的细胞内功能 。
- 拓宽可及的进化序列空间：研究发现 RNA 核苷类似物莫努匹拉韦（molnupiravir）可以将 PROTEUS 的突变率提高 8 倍，并改变突变偏好，这为未来增强 PROTEUS 在定向进化中的效用提供了可能 。
研究结论与讨论
研究人员开发的 PROTEUS 平台，成功解决了以往哺乳动物定向进化策略中的关键问题，利用嵌合病毒样囊泡（VLVs），在维持系统完整性的同时，实现了长时间的定向进化。该平台能够生成真实的进化产物，优化现有的分子工具，还可用于细胞内纳米抗体的定向进化。不过，该研究也存在一定的局限性，比如存在 ADAR 介导的突变偏好，虽然可以通过一些方法改变，但仍需进一步探索；并且对于更复杂的靶点和电路设计，维持系统平衡可能更具挑战性。此外，PROTEUS 目前仅在仓鼠 BHK21 细胞中发挥作用，未来需要拓展到其他哺乳动物细胞类型。
总体而言，PROTEUS 平台为在哺乳动物细胞环境中进化蛋白质活性提供了有力的工具，有助于科研人员开发和优化用于复杂哺乳动物系统的生物分子，推动生命科学和健康医学领域的发展。它就像一把钥匙，为打开哺乳动物细胞定向进化的大门提供了可能，为后续的研究开辟了新的道路 。
