高性能荧光传感器HypnoS在体揭示细胞特异性胞内腺苷动态调控机制

为解决胞内腺苷(iAdo)动态监测技术瓶颈，北京大学等团队开发了基因编码荧光传感器HypnoS，通过结合Plasmodium vivax腺苷脱氨酶(PvADA)与cpEGFP，实现了活体细胞、脑片及自由活动小鼠中iAdo的高灵敏度(EC50 10.9μM)、高特异性实时成像。研究揭示了癫痫发作中iAdo波与钙信号的时空耦合关系，并发现睡眠-觉醒周期中iAdo受ENT1/2转运体调控，为代谢-神经调控研究提供了革命性工具。成果发表于《Nature Communications》。

　　

腺苷（Adenosine, Ado）作为连接细胞代谢与通讯的关键分子，在睡眠调控、癫痫抑制等生理病理过程中发挥核心作用。然而，传统技术难以区分胞内腺苷(iAdo)与胞外腺苷(eAdo)的动态变化，更无法实现细胞特异性观测。尽管GRAB_Ado传感器已用于eAdo研究，但iAdo的时空分布规律及其与神经元活动的关系仍是未解之谜。这一技术空白严重阻碍了对腺苷双重角色（代谢物与神经调质）的深入理解，特别是在癫痫发作终止、睡眠稳态维持等关键场景中。

为解决这一挑战，北京大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所等团队通过蛋白质工程改造，将疟原虫腺苷脱氨酶(PvADA)与环化绿色荧光蛋白(cpEGFP)融合，开发出新型基因编码传感器HypnoS。该传感器具有929%荧光响应幅度、10.9μM亲和力及亚秒级响应速度，可特异性识别iAdo而忽略ATP、ADP等干扰分子。研究通过双光子成像、纤维光度术等技术，在培养细胞、果蝇和小鼠模型中系统验证了其性能，并首次揭示了癫痫发作时皮层iAdo波的传播规律及其与钙信号的时序关系，同时阐明了基底前脑神经元中ENT1/2依赖的iAdo睡眠-觉醒调控机制。

关键技术方法包括：1) 基于PvADA结构的理性设计构建传感器库；2) 双光子显微成像追踪活体动物单细胞iAdo动态；3) 跨窦病毒注射实现全皮层表达；4) 光纤记录自由活动小鼠睡眠周期信号；5) CRISPR-Cas9构建ENT1/2双敲除模型。

研究结果：

1. HypnoS传感器开发：通过分析PvADA的α7结构门构象变化，在175位点插入cpEGFP，经2500个变体筛选获得最佳版本HypnoS。体外实验显示其对Ado的响应不受pH(7.0-8.0)和温度(22-37℃)影响，且无腺苷脱氨酶活性干扰。

2. 细胞特异性iAdo动态：在神经元-胶质共培养体系中，电刺激或代谢抑制(2-DG处理)可诱导神经元iAdo显著升高(伴随ATP/ADP比值下降)，而星形胶质细胞无此响应，揭示两类细胞差异代谢途径。

3. 癫痫模型中的时空规律：通过双色介观成像发现，海人酸(KA)诱导的癫痫发作会触发皮层iAdo波(75μm/s)，滞后钙波约20秒但衰减更慢(100秒)。双光子成像进一步显示，星形胶质细胞的iAdo清除速度显著快于神经元(τ_off 38.8s vs 146.3s)。

4. 睡眠-觉醒调控机制：基底前脑光纤记录发现，觉醒期与REM睡眠期神经元iAdo水平显著高于NREM期，且ENT1/2双敲除小鼠该差异消失，证实转运体对iAdo动态的关键调控作用。

结论与意义：
该研究突破了活体iAdo监测的技术壁垒，首次实现从单细胞到整体动物的多尺度观测。发现癫痫中iAdo波的延迟出现提示其可能作为"刹车信号"参与发作终止，而星形胶质细胞的快速清除能力解释了其对神经保护的时空特异性调控。睡眠研究则揭示了ENT1/2介导的iAdo-eAdo耦合机制，为开发靶向腺苷代谢的抗癫痫药物或促眠疗法提供了新视角。HypnoS的广泛应用将推动对帕金森病、中风等腺苷相关疾病的机制解析。

值得关注的是，研究者还发现神经元活动与iAdo升高存在直接关联——在果蝇蘑菇体神经元中，光遗传激活可诱发频率依赖的iAdo增加，这为"神经活动-代谢反馈"理论提供了直接证据。未来通过开发红移变体，有望实现多信号并行监测，进一步揭示腺苷在神经血管耦合、免疫调控等过程中的复杂作用网络。