编辑推荐：
睾丸衰老常引发睾酮缺乏和精子发生受损，现有睾酮替代疗法（TRT）存在诸多弊端。研究人员聚焦睾丸衰老机制展开研究，发现莱迪希细胞（Leydig cells）中酮生成受损会加速睾丸衰老，而增强酮生成可缓解这一过程，为治疗睾丸衰老提供新方向。
在男性的生命历程中，睾丸扮演着至关重要的角色，它不仅负责精子的生成，还承担着合成男性性激素的重任。然而，随着年龄的增长，睾丸也会逐渐衰老。这一变化带来的影响可不小，睾酮分泌减少，不仅会让男性的生殖功能大打折扣，还会影响他们的生活质量；精子发生过程出现异常，更是导致男性不育的重要原因之一。目前，针对睾丸衰老，常用的睾酮替代疗法（Testosterone Replacement Therapy，TRT）存在不少问题，比如会增加心血管疾病的风险，还可能加重睡眠呼吸暂停综合征，甚至有引发前列腺癌的潜在风险，而且它无法模拟睾酮的生理分泌模式，对精子发生也有负面影响。因此，探索新的治疗策略迫在眉睫。
为了深入了解睾丸衰老的机制，来自中山大学的研究人员展开了一系列研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为解决睾丸衰老相关问题带来了新的希望。
研究人员在此次研究中，主要运用了单细胞 RNA 测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、基因编辑技术等关键方法。scRNA-seq 技术让研究人员能够从单细胞层面解析睾丸细胞的基因表达变化，而基因编辑技术则帮助他们构建基因敲除和过表达的动物模型，深入探究基因功能。
莱迪希细胞在小鼠衰老过程中易发生衰老
研究人员选取了年轻（2 个月大）和年老（24 个月大）的小鼠，对其睾丸进行研究。通过形态学分析发现，年老小鼠的睾丸生精小管直径变小，生精上皮厚度变薄；精子分析也显示，年老小鼠的精子浓度和活力显著下降。性激素水平检测结果表明，年老小鼠血清和睾丸内的睾酮水平明显降低，胰岛素样肽 3（Insulin-like peptide 3，Insl3，一种反映莱迪希细胞功能的指标）水平也有所下降，而促黄体生成素（Luteinizing Hormone，LH）和促卵泡生成素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）水平则升高。这些结果充分表明，年老小鼠的睾丸出现了明显的衰老迹象。
为了进一步探究睾丸细胞的衰老情况，研究人员进行了衰老相关 β- 半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色。结果发现，早在 8 个月大时，小鼠睾丸中的 SA-β-gal 阳性细胞就开始显著增加，且这些细胞主要位于睾丸间质。通过与细胞标记物的共染色分析，研究人员确定这些衰老细胞主要是莱迪希细胞，这表明莱迪希细胞在睾丸衰老过程中极易受到影响。
睾丸衰老的单细胞转录组分析揭示莱迪希细胞的衰老特征
研究人员对年轻和年老小鼠的睾丸细胞进行了 scRNA-seq 分析，成功鉴定出 7 种细胞类型，包括莱迪希细胞、间充质细胞、巨噬细胞、精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞和伸长精子细胞。进一步对莱迪希细胞簇进行分析发现，年轻和年老小鼠的莱迪希细胞呈现出两个不同的亚群，且年老小鼠莱迪希细胞中衰老相关标记基因 p21（即细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1A，Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 A，Cdkn1a）和 Cxcl10 的表达显著上调。定量 RT-PCR 和免疫染色分析也证实了这一结果，表明睾丸衰老伴随着衰老莱迪希细胞的积累，这可能是导致睾丸形态和功能改变的重要原因。
年老小鼠衰老的莱迪希细胞存在酮生成受损
研究人员通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）发现，年老莱迪希细胞中上调的基因主要与炎症反应相关，而下调的基因则主要富集在代谢相关的通路中。在这些差异表达基因中，Hmgcs2 基因的变化最为显著，它编码酮生成的限速酶，在年老莱迪希细胞中表达明显下调。进一步分析发现，年老莱迪希细胞中其他酮生成相关酶的基因表达也有所下降，睾丸内酮体（β- 羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHB）和乙酰乙酸（acetoacetic acid，AcAc））的浓度也显著降低，而血清中的酮体浓度在年轻和年老小鼠之间并无明显差异。这一系列结果表明，年老睾丸的莱迪希细胞中酮生成受到了损害。
抑制酮生成诱导莱迪希细胞体外衰老
为了探究酮生成受损是否会导致莱迪希细胞过早衰老，研究人员用 HMGCS2 抑制剂 Hymeglusin 处理 MLTC-1 细胞（一种莱迪希细胞系）。结果显示，Hymeglusin 处理后，MLTC-1 细胞中的酮体水平降低，SA-β-gal 阳性细胞数量增加，衰老标记物 γ-H2AX、H2AY 表达增加，Lamin B 表达减少，衰老相关基因 p21 和纤溶酶原激活剂抑制剂 - 1（Plasminogen activator inhibitor-1，Pai1）的表达上调，同时细胞的类固醇生成功能也受到抑制，培养基中孕酮水平下降。此外，研究人员还通过基因编辑技术敲低 Hmgcs2 基因，得到了类似的结果，这充分表明抑制酮生成会驱动莱迪希细胞的衰老。
Hmgcs2 基因敲除导致年轻小鼠莱迪希细胞衰老和睾丸衰老
研究人员构建了 Hmgcs2 基因条件性敲除的小鼠模型，通过腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的基因编辑技术，在 8 周龄的 Hmgcs2flox/flox小鼠睾丸中敲除 Hmgcs2 基因。结果发现，敲除 Hmgcs2 基因后，小鼠睾丸内 BHB 和 AcAc 的浓度显著下降，SA-β-gal 阳性莱迪希细胞数量增加，衰老标记物 p21 表达上调，血清和睾丸内睾酮浓度降低，Insl3 浓度下降，LH 浓度升高，睾丸生精上皮变薄，精子浓度降低。这些结果表明，酮生成对莱迪希细胞具有保护作用，Hmgcs2 基因缺失会导致莱迪希细胞过早衰老，加速睾丸衰老进程。
酮生成对莱迪希细胞的保护作用由 BHB 而非 AcAc 介导
研究人员分别用 BHB 和 AcAc 处理 Hymeglusin 处理后的 MLTC-1 细胞以及 Hmgcs2 基因敲低的 MLTC-1 细胞，发现 BHB 能够减轻细胞衰老，降低 SA-β-gal 阳性细胞比例，下调衰老标记物 p16、p53、p21 和 Pai1 的表达，恢复细胞的类固醇生成功能，而 AcAc 则没有这些作用，甚至在某些情况下会加重细胞衰老。此外，BHB 还能减轻过氧化氢（H2O2）、阿霉素（doxorubicin，DXR）和电离辐射（ionizing radiation，IR）诱导的细胞衰老，而 AcAc 依然无效。这些结果表明，BHB 是介导酮生成对莱迪希细胞保护作用的关键物质。
BHB 通过增强组蛋白乙酰化减轻睾丸衰老
研究人员深入探究 BHB 减轻莱迪希细胞衰老的分子机制，发现 BHB 作为一种内源性组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂，能够剂量依赖性地上调 MLTC-1 细胞中组蛋白 H3 赖氨酸 9（H3K9）的乙酰化水平（H3K9ac），但不会增加 H3K9 的 β- 羟基丁酰化（Kbhb）水平。进一步研究表明，BHB 通过抑制 HDAC1 的活性，增强 Foxo3a 基因启动子区域的 H3K9ac 修饰，从而上调 Foxo3a 的表达，减轻细胞衰老。敲低 HDAC1 或 Foxo3a 基因后，BHB 的保护作用消失，这充分证实了 BHB 通过抑制 HDAC1 来促进 Foxo3a 表达，进而减轻细胞衰老的作用机制。
增强酮生成减轻老年小鼠莱迪希细胞衰老和睾丸衰老
研究人员利用 AAV 载体在老年小鼠（15 个月大）的莱迪希细胞中过表达 Hmgcs2 基因，结果发现，过表达 Hmgcs2 基因后，小鼠睾丸内 BHB 水平显著升高，接近年轻小鼠的水平，H3K9ac 和 Foxo3a 的表达也增加，SA-β-gal 阳性莱迪希细胞数量减少，衰老标记物 p21 和 Cxcl10 的表达下调，血清和睾丸内睾酮浓度升高，Insl3 浓度增加，LH 浓度降低，睾丸生精小管直径增大，生精上皮增厚，精子浓度显著提高。这些结果表明，增强酮生成能够有效减轻老年小鼠莱迪希细胞的衰老，改善睾丸功能，延缓睾丸衰老。
口服 BHB 改善老年小鼠睾丸功能
研究人员给老年小鼠（18 个月大）口服 BHB 盐制剂，发现口服 BHB 后，小鼠血清和睾丸内 BHB 水平升高，H3K9ac 和 Foxo3a 的表达增加，SA-β-gal 阳性莱迪希细胞数量减少，衰老标记物 p21 和 Cxcl10 的表达下调，血清和睾丸内睾酮浓度升高，Insl3 浓度增加，LH 浓度降低。虽然精子分析显示口服 BHB 对精子浓度、活力和前向运动能力没有显著影响，但整体结果表明，口服 BHB 能够减轻莱迪希细胞的衰老，缓解睾丸衰老。
研究结论表明，莱迪希细胞是睾丸中最易衰老的细胞，Hmgcs2 基因在莱迪希细胞衰老过程中表达下调，敲除 Hmgcs2 基因会损害睾丸中的酮生成，导致莱迪希细胞衰老和睾丸衰老。相反，通过基因操作或饮食干预增强酮生成，能够有效减轻莱迪希细胞衰老，恢复睾丸功能。这一研究成果揭示了酮生成在维持睾丸稳态中的关键作用，为延缓睾丸衰老提供了新的潜在治疗策略。同时，研究也存在一些局限性，比如未对处理后老年小鼠的生育能力进行评估，Foxo3a 在睾丸中的作用还需进一步深入研究。未来的研究可以围绕这些方向展开，进一步完善对睾丸衰老机制的理解，为解决男性生殖健康问题提供更有效的方案。
