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为探究癌细胞对吉西他滨耐药机制，研究人员运用 IMPRINTS-CETSA 技术研究敏感和耐药弥漫大 B 细胞淋巴瘤细胞系。结果发现耐药细胞有独特 DNA 损伤修复及细胞周期调控机制，ATR 抑制剂可逆转耐药。该研究为癌症治疗提供新靶点和策略。
在癌症治疗的战场上，吉西他滨（gemcitabine）作为常用的细胞毒性抗癌药物，广泛应用于多种癌症的治疗，如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和淋巴瘤等。然而，癌细胞对吉西他滨产生的耐药性却成为了治疗路上的 “拦路虎”，严重阻碍了治疗效果。就拿弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）来说，这是一种常见且侵袭性强的非霍奇金淋巴瘤，虽然以蒽环类药物为基础的 R-CHOP 方案是一线治疗的标准方案，但仍有 20 - 50% 的患者对治疗无反应或在两年内复发。吉西他滨在 DLBCL 的挽救治疗中也常因耐药问题而效果不佳。
目前，研究癌细胞对吉西他滨耐药机制面临诸多挑战。传统的基因组或转录组学方法虽能发现一些与耐药相关的基因突变和 RNA 水平变化，但细胞通路和过程在生化层面的高度调控信息却难以通过这些方法获取。而且，这些方法无法研究药物诱导的细胞反应，而这恰恰在癌细胞耐药过程中起着关键作用。此外，现有的一些针对特定耐药机制的研究方法，需要预先知晓可能的耐药机制，无法全面、无偏地揭示耐药过程中的调控事件序列。
为了攻克这些难题，来自新加坡科技研究局（A*STAR）分子与细胞生物学研究所（IMCB）、新加坡基因组研究所（GIS）、卡罗林斯卡学院、新加坡国立大学癌症科学研究所等机构的研究人员开展了一项重要研究。他们运用深度功能蛋白质组学方法 IMPRINTS-CETSA（Integrated Modulation of Protein Interaction States - Cellular Thermal Shift Assay，整合蛋白相互作用状态调节 - 细胞热迁移分析），深入探究了吉西他滨诱导的耐药机制，相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
在研究方法上，研究人员主要采用了以下几种关键技术：一是 MTT 细胞活力测定法，用于评估细胞在药物处理后的活力；二是细胞热迁移分析（CETSA），包括在完整细胞和细胞裂解物中的实验，通过监测蛋白质相互作用状态的变化来反映细胞内生化通路的激活情况；三是蛋白质组学分析，对细胞进行定量蛋白质组学分析，以研究蛋白质水平的变化；四是细胞周期分析和流式细胞术，用于分析细胞周期分布；五是核苷酸定量，通过 LC - MRM/MS 技术测定细胞内核苷酸的含量。研究使用的样本包括多种细胞系，如人乳腺癌细胞系 MDA - MB - 231、人淋巴瘤细胞系 SUDHL4、HT、OCI - LY19 和 OCI - LY3 等，以及 DLBCL 患者的临床样本。
研究结果如下：
- 吉西他滨与 RNR 的相互作用：吉西他滨与核糖核苷酸还原酶（RNR）的结合在敏感和耐药细胞中均导致 RRM1 亚基的热稳定化，且在不同时间点和不同剂量下都有相似表现，这表明吉西他滨对 RNR 的抑制作用在两种细胞类型中相似，排除了药物内化和代谢改变是主要耐药机制的可能性。
- DNA 损伤反应的启动：吉西他滨处理后，敏感和耐药细胞均启动 DNA 损伤反应，参与单链 DNA（ssDNA）损伤和复制叉停滞传感与信号传导的 RPA1、RPA2、RPA3 和 CHEK1 等蛋白出现相似的热稳定性变化。但 DNMT1 的热稳定性变化机制与已知的 DNMT1 抑制剂不同，可能是由于其与其他蛋白或 DNA 在复制叉处的相互作用发生了改变。
- 敏感细胞的凋亡与耐药细胞的细胞周期调控：敏感细胞在吉西他滨处理后呈现出典型的 CETSA 凋亡特征，多种凋亡相关蛋白出现热稳定性变化，PARP1 的切割也证实了这一点，且凋亡过程呈现时间依赖性。而耐药细胞则表现为细胞周期调节蛋白的变化，促进了细胞周期的进展，细胞周期分析显示敏感细胞出现 G1 期阻滞，耐药细胞则正常循环。
- DDR 引发的转损伤 DNA 合成作为耐药机制：耐药细胞在吉西他滨处理后，出现转损伤 DNA 合成（TLS）相关蛋白的变化，如 PCLAF 和 DTL 的热稳定化、POLD1、POLD2 和 POLD4 的热不稳定化，且仅在耐药细胞中观察到 PCNA 的单泛素化，表明 TLS 被激活。干扰 TLS 可增强吉西他滨的作用，揭示了 TLS 在耐药中的重要作用。
- 辅助 DNA 损伤修复（ADDR）反应：吉西他滨处理后，耐药细胞中一组包括 RRM2、TK1、GMNN、SLBP 和 FBXO5 等蛋白的辅助 DNA 损伤修复（ADDR）反应蛋白表达上调，且该反应在其他 DNA 损伤药物处理及不同细胞系中也存在，提示其在耐药中具有广泛作用。
- ATR 抑制对吉西他滨耐药的影响：使用 ATR（ataxia telangiectasia and Rad3 - related protein，共济失调毛细血管扩张症和 Rad3 相关蛋白）抑制剂 AZD6738 处理耐药细胞，可显著降低吉西他滨的 IC50值，逆转耐药。同时，ATR 抑制可减弱 TLS 和 ADDR 相关蛋白的诱导，表明 ATR 是这一耐药反应的关键信号节点。
- CETSA 在临床样本中的应用：对 DLBCL 患者的临床样本进行 MS - CETSA 实验发现，这些样本对吉西他滨仍敏感，主要表现为 CETSA 凋亡相关蛋白的变化，说明 MS - CETSA 可用于临床样本的耐药性评估。
研究结论和讨论部分指出，该研究通过时间依赖性的 IMPRINTS-CETSA 技术，全面揭示了吉西他滨在敏感和耐药细胞中的生化反应差异，发现了耐药细胞中 TLS 和 ADDR 反应在吉西他滨耐药中的关键作用，以及 ATR 作为调控这一过程的关键信号节点。这为吉西他滨耐药机制提供了新的见解，也为开发针对 DLBCL 等癌症的联合治疗方案提供了理论依据。ATR 抑制剂与吉西他滨联合使用可逆转耐药性，在临床治疗中具有潜在应用价值。此外，研究还强调了监测药物诱导反应对于揭示耐药机制的重要性，而 MS-CETSA 技术有望成为临床样本耐药机制监测的有效工具，为个性化治疗提供有力支持。总之，这项研究为癌症治疗领域开辟了新的方向，具有重要的理论和实践意义。
