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为解决钩端螺旋体病诊断困难、现有核酸扩增检测受限的问题，研究人员开发微流控 PCR（mbPCR）检测致病钩端螺旋体。结果显示该方法能直接检测血液样本，灵敏度良好。这有望实现即时诊断，助力疾病防控。
钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体引发的全球性人畜共患病。想象一下，在一些热带地区，洪水过后，环境被感染动物的尿液污染，人们在不知情的情况下接触，就容易感染钩端螺旋体病。这种病的症状很不典型，发热、头痛、肌肉疼痛这些表现，和登革热、疟疾等疾病太相似了，医生很难快速准确判断。而且，现有的诊断方法都不太给力。暗视野显微镜检查灵敏度低，还特别考验医生的经验；血培养不仅需要特殊培养基，等结果的时间长达 13 周；血清学检测在感染早期没什么用，还可能出现假阳性。核酸扩增检测虽然不错，但对设备和人员要求高，在资源匮乏地区根本没法广泛使用。在这样的困境下，为了找到更好的诊断方法，来自日本职业与环境卫生大学的研究人员开展了一项研究，他们的成果发表在《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》上。研究人员开发了一种基于微流控技术的 PCR（mbPCR）检测方法，用来检测致病性钩端螺旋体。这项研究意义重大，如果能广泛应用，就能及时诊断钩端螺旋体病，尤其是在资源有限的地区，能帮助医生更快做出治疗决策，拯救更多患者的生命。
研究用到的主要关键技术方法有：选用 17 种钩端螺旋体菌株和雄性金黄地鼠开展实验。利用 QIAamp DNA Mini Kit 等试剂盒提取基因组 DNA。采用特定的 PCR 引物和探针，分别用于微流控 PCR 和常规实时定量 PCR。通过制备标准曲线、检测不同样本等方式评估 mbPCR 性能。
研究结果
- mbPCR 的分析特性：开发的 mbPCR 将 PCR1100 设备与针对致病性钩端螺旋体 16S rDNA 的引物和探针结合。每个检测 45 个循环只需 35 分钟。对钩端螺旋体 interrogans 血清型 Manilae 菌株 L495 的 DNA 检测显示，在 101 - 105 GEq/μL 范围内，Ct 值与样本 DNA 浓度呈线性相关（R2=0.9945）。该方法能准确区分致病性和非致病性钩端螺旋体。
- mbPCR 直接检测添加到 PBS 中的钩端螺旋体：不用纯化 DNA，mbPCR 就能检测添加到 PBS 中的活致病性钩端螺旋体菌株 L495。经概率单位分析，检测下限为 7.78 条钩端螺旋体 /μL（95% 置信区间 3.83 - 15.8 条 /μL）。实验还发现，经过 10 个循环，77% 的 DNA 会释放到细胞外。
- mbPCR 直接检测添加到仓鼠和人类全血中的钩端螺旋体：将活钩端螺旋体添加到仓鼠和人类的 EDTA 抗凝血中检测。在全血中，该方法能 100% 检测到 1×102条 /μL 以上的钩端螺旋体，1×101条 /μL 时阳性率为 17%。而且，肝素和柠檬酸钠作为抗凝剂不影响检测结果。
- 在仓鼠模型中直接 PCR 检测钩端螺旋体：用感染钩端螺旋体的仓鼠全血样本测试 mbPCR。感染后第 5 天，mbPCR 阳性率为 50%，第 7 天和第 8 天达到 100%。这表明 mbPCR 能直接从感染动物的 1μL 全血中检测到钩端螺旋体，无需 DNA 纯化。
研究结论和讨论部分指出，微流控技术让 mbPCR 检测钩端螺旋体变得更简单、快速、灵敏。它不用 DNA 纯化，还能分离血细胞，避免其对检测的干扰。虽然全血检测下限比 PBS 中高，但仍能检测出严重钩端螺旋体病患者血液中的病原体。而且，mbPCR 用血量少，和常用抗凝剂兼容，适合在基层医疗单位使用，有助于早期诊断和治疗。不过，该研究也有局限性，只测试了一种致病菌株，还未用人类临床样本评估。未来需要更多研究来验证其准确性、临床效果和成本效益。总体而言，mbPCR 为钩端螺旋体病的诊断带来了新的希望，有望改变诊断现状，尤其是在资源匮乏地区，对改善患者预后意义重大。
