新型高灵敏度特异性多重实时PCR技术在杜氏利什曼原虫与HIV-1共感染诊断中的应用研究

本研究针对HIV-1与杜氏利什曼原虫（L. donovani）共感染诊断难题，开发了基于LTR（HIV-1）和ITS1（L. donovani）靶标的多重实时PCR（RT-PCR）检测技术。该技术灵敏度达1 fg/μL（HIV-1）和100 fg/μL（L. donovani），无交叉反应，与常规PCR一致性达100%（kappa=1），为资源有限地区提供高效精准的共感染诊断方案，可显著降低治疗失败率和VL复发风险。

　　

在热带和亚热带地区，杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）引发的内脏利什曼病（VL）与HIV-1的共感染已成为严峻的公共卫生挑战。这两种病原体地理分布重叠区域的感染者常面临更高的死亡风险，而现有诊断方法因HIV导致的免疫抑制使抗体检测（如DAT）灵敏度骤降，临床误诊率高达40%。更棘手的是，VL会通过上调CD4⁺细胞表面HIV共受体加速病毒复制，形成恶性循环。尽管WHO报告全球HIV感染者中VL患病率为6%，但东非部分区域如埃塞俄比亚竟高达20-40%，且共感染者VL复发率比单纯感染者高出5-10倍。

为解决这一难题，肯尼亚医学研究所（KEMRI）与泛非大学基础科学研究所的Moses Sanya团队开发了首款同步检测HIV-1和L. donovani的多重实时PCR技术。该研究选择HIV-1基因组的长末端重复序列（LTR）和L. donovani的内部转录间隔区1（ITS1）作为靶点，以人β-肌动蛋白基因作为内参。通过分析临床存档样本和ATCC标准品，发现该技术对HIV-1和L. donovani的检测限分别达1 fg/μL和100 fg/μL，且与利什曼原虫近缘种L. major无交叉反应。在诊断性能验证中，其与常规PCR结果完全一致（kappa=1），全程可在单管反应中完成，大幅节省检测成本。

关键技术包括：1）基于LTR和ITS1保守区设计特异性引物探针；2）使用qTower384实时荧光定量系统进行单重/多重PCR优化；3）采用KEMRI提供的HIV-1阳性样本和VL患者样本进行验证。

研究结果显示：在灵敏度测试中，HIV-1单重检测限达0.000001 ng/μL（约1病毒拷贝/μL），而L. donovani为0.0001 ng/μL；多重检测时灵敏度与单重相当。特异性实验中，L. major等近缘种均未出现非特异性扩增。临床样本验证阶段，所有经传统PCR确认的共感染样本均被准确检出，且β-肌动蛋白内参有效监控了提取质量。

讨论部分指出，该技术突破性地解决了共感染诊断中的三大瓶颈：首先，其核酸直接检测模式规避了HIV患者抗体应答缺陷的问题；其次，多重设计可同步监控样本质量和感染状态；最后，1 fg级灵敏度足以检测早期无症状感染。虽然目前尚未在活跃共感染队列中验证，但该技术已展现出改变临床实践的巨大潜力——据估算，其应用可使东非地区VL-HIV患者的诊断周期从2周缩短至4小时，治疗失败率有望降低50%以上。

这项发表于《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》的研究，不仅为资源有限地区提供了首个经标准化的共感染分子诊断方案，更开创性地证实了LTR-ITS1靶标组合的临床适用性。未来若能在更大规模的前瞻性研究中验证，该技术或将成为WHO推荐的首选诊断工具，对实现2030年消除VL作为公共卫生威胁的目标具有战略意义。