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本文聚焦纺锤体组装检查点（SAC），阐述其在染色体分离保真度方面的关键作用。介绍 SAC 信号传导过程、特性，以及以 Aurora B 和单极纺锤体激酶（MPS1）等为靶点的抗癌药物研发策略，为癌症治疗研究提供重要参考。
纺锤体组装检查点
细胞周期是一个有序的动态过程，为保证遗传稳定性，真核细胞进化出了细胞周期检查点机制，其中纺锤体组装检查点（SAC）负责监控染色体与功能性纺锤体微管（MTs）的附着情况 ，确保染色体在有丝分裂时能均匀分配到两个子细胞中，延迟有丝分裂退出，直至染色体实现双极附着。
染色体不稳定（CIN）是癌症的常见特征，许多癌细胞存在染色体错分离现象。缺乏 SAC 的细胞在染色体错分离时会加速有丝分裂退出并迅速死亡，而异常的 SAC 反应在肿瘤发展中起重要作用。目前已开发出通过激活 SAC 诱导细胞死亡的抗有丝分裂药物，如紫杉醇等 MT 靶向药物，但这类药物存在耐药性、神经毒性和造血系统副作用等问题。因此，第二代抗有丝分裂药物聚焦于不直接破坏 MTs 的方法，SAC 相关蛋白成为开发新型抗癌方法的有前景的靶点。
在有丝分裂过程中，染色体需先附着到纺锤体 MTs 并在细胞赤道板排列整齐，才能进入后期。如果染色体排列出现错误，SAC 会阻止后期启动。着丝粒是大型大分子复合物，能结合着丝粒 DNA，在有丝分裂时将 MT 解聚的力量转化为染色体运动的动力 。在完全附着之前，着丝粒与 MTs 的结合方式多样，包括错误结合到错误的纺锤极或结合的 MTs 数量不足等，这种不完全结合会激活 SAC，促使有丝分裂检查点复合物（MCC）形成，进而抑制后期促进复合物 / 环体（APC/C），阻止细胞周期进程。
APC/C 是一种 E3 泛素连接酶，能通过靶向降解细胞周期蛋白 B1 和分离酶抑制蛋白（后期和胞质分裂的抑制剂），控制细胞分裂中的两个不可逆事件，即后期染色体分离和随后的胞质分裂 。在细胞分裂周期的每个有丝分裂阶段开始时，SAC 都会抑制 APC/C 的活性，直到所有染色体都正确附着到纺锤体 MTs 上。MCC 是一种可扩散的后期抑制剂，由有丝分裂阻滞缺陷蛋白（MAD）2、苯并咪唑不抑制芽殖蛋白（BUB）3、BUBR1 和细胞分裂周期蛋白 20（CDC）20 四种蛋白质组成 。该复合物与 APC/CCDC20结合，抑制分离酶抑制蛋白和细胞周期蛋白 B 的泛素化，从而阻止后期启动。
单极纺锤体激酶 1（MPS1，人类中也称为苏氨酸 / 酪氨酸激酶（TTK））是 SAC 激活和 MCC 产生的关键调节因子 。在核膜破裂前约 10 分钟，MPS1 被激活，促进有丝分裂前 MCC 在核孔处组装 。细胞进入有丝分裂后，MPS1 通过 NDC80 复合物（负责与 MTs 结合的着丝粒组件）与着丝粒支架 1（KNL1）–MIS12–NDC80（KMN）网络结合 。研究表明，MPS1 优先结合缺乏 MT 结合的着丝粒，从而协调 SAC 信号级联反应。
MPS1 磷酸化 KNL1 的蛋氨酸–谷氨酸–亮氨酸–苏氨酸（MELT）基序中的苏氨酸残基，招募 BUB1–BUB3 复合物 。接着，BUB1 招募 BUBR1–BUB3 异二聚体 。BUBR1 是一种特殊的假激酶，能与 CDC20 广泛相互作用，为 MCC 形成和 APC/C 抑制提供关键活性 。BUB1 通过与 MAD1 直接相互作用，吸引 MAD1–MAD2 异四聚体 。MPS1 激活后，磷酸化 MAD1 的保守结构域 1（CD1），使 MAD1 的精氨酸–亮氨酸–赖氨酸（RLK）序列与 BUB1 上的 CD1 结合 。随后，游离的 “开放”（O）-MAD2 分子招募并转变为 “封闭” 形式，这一过程是 MCC 形成的关键步骤 。MCC 形成的限速步骤是 O-MAD2 向 C-MAD2 的转化，当前模型认为 MPS1、SAC 支架蛋白 BUB1 和 MAD1–MAD2 以及 MCC 亚基的邻近度、定位和构象转变状态促进了 MCC 的快速形成。
着丝粒与 MTs 结合的关键活动涉及由 KNL1、MIS12 和 NDC80 组成的 KMN 网络 。当 MTs 无法与该网络结合时，SAC 信号蛋白会产生后期抑制剂，确保检查点保持激活状态 。只有当染色体实现双定向，即姐妹染色单体对的两个着丝粒都与连接到相反纺锤极的 MTs 建立稳定的端对端相互作用时，SAC 信号才会沉默 。在实现双定向之前，染色体可能存在各种中间 MT 附着状态，错误校正机制会将错误附着状态恢复为未附着状态，以便 SAC 蛋白重新组装，确保后期延迟，直至所有错误得到纠正。
细胞中未附着着丝粒的数量与产生的 MCC 数量直接相关，一般来说，未附着着丝粒的数量预示着 SAC 信号的强度，但这种关系并非线性 。例如，当关键 SAC 组件的表达或活性不足时，即使并非所有染色体都双定向，微弱的 SAC 信号也可能使细胞难以阻止后期进程。
SAC 需要具备对单个未附着着丝粒快速响应的能力，一旦激活，无论附着着丝粒数量如何波动，细胞都需维持强烈的 SAC 响应 。而当最后一个着丝粒附着后，细胞又必须能够迅速关闭该响应 。SAC 响应具有敏感性、稳健性和响应性三个关键特性 。激酶 - 磷酸酶反馈回路，尤其是作用于 KNL1 的反馈回路，在 SAC 响应中起核心作用。
敏感性
SAC 的敏感性体现在少数着丝粒未附着时就能引发强烈响应 。人类 KNL1 中约有 19 个 MELT 样基序，其中约 8 个具有显著但可变的结合 BUB1–BUB3 的能力 。这些 MELT 基序的协同作用使得少量高亲和力的 MELT 基序磷酸化就能诱导强烈的 SAC 响应 。由于 MELT 基序的协同作用，相应的有丝分裂延迟并非呈线性变化 。在着丝粒处，Aurora B 的活性使蛋白磷酸酶（PP）1 无法与 KNL1 结合，可能通过增强 MPS1 对 MELT 基序的活性来促进 SAC 的敏感性 。虽然 MELT 基序协同行为的确切机制尚不清楚，但在少数着丝粒脱离的情况下，它对确保足够的 MCC 产生可能至关重要。
响应性
SAC 在激活和失活方面都需要具有响应性，即能根据 MT 附着状态迅速启动或终止响应 。例如，在人类 HeLa 细胞中，着丝粒脱离后 2 分钟内就能结合大量 MAD2 。KNL1 在 SAC 响应性中起重要作用，它是磷酸酶负反馈回路的中心，该回路可能涉及磷酸酶 PP2A–B56、PP1 和激酶 Aurora B 。当 MTs 与着丝粒结合时，SAC 激酶会招募 PP2A–B56，使 KNL1 上的 PP1 结合位点去磷酸化，导致 PP1 结合并使 SAC 失活 。相反，若 MTs 未与着丝粒结合，Aurora B 会继续磷酸化 KNL1 的 RVSF 结构域，阻止 PP1 结合，从而维持 SAC 激活状态 。当 MTs 脱离着丝粒时，KNL1 不会结合 PP2A–B56，使 SAC 准备激活 。随着 MTs 重新结合，Aurora B 的输入减少，SAC 迅速关闭 。
KNL1 的 MELT 残基数量对 SAC 响应性也至关重要，磷酸化的 MELT 基序数量必须足够引发响应，但又要受到控制，以便 SAC 能迅速失活 。如果所有着丝粒都未连接且产生 MCC，一旦着丝粒与 MTs 建立必要连接，细胞必须能够迅速使 SAC 失活 。可以通过调节 MCC 亚基的表达水平来减少多余的 MCC，因为这可以降低多个 MELT 结构域磷酸化时的协同作用 。在人类细胞中，正确数量的 MELT 基序对于维持染色体分离保真度至关重要，它可以调节 SAC 信号强度并纠正附着错误。
稳健性
稳健性是指 SAC 在启动后能够抵御刺激随时间的波动 。MELT 基序在低磷酸化水平时的协同作用和高磷酸化水平时的非协同作用，使 MCC 的数量能够抵抗信号着丝粒数量的减少 。细胞对 BUB1 和 MAD1 蛋白水平的显著降低具有耐受性，这表明 SAC 可能通过其他机制增强其稳健性 。例如，可能依赖于纤维冠，它能提供额外的 MAD1 结合位点，并增强 MPS1 激酶活性对部分 NDC80 复合物附着到 MTs 时 MPS1 激酶活性降低的响应 。
在 SAC 蛋白水平的调节，特别是维持 MCC 组件的严格表达，也可能是 SAC 稳健性的另一种机制 。在裂殖酵母中观察到了这种调节活动，鉴于人类 SAC 对 BUBR1 或 MAD2 水平的敏感性增加，这种机制可能也与人类 SAC 相关 。秀丽隐杆线虫的研究表明，细胞体积可以通过改变 MCC 的浓度影响 SAC 强度，但关于人类细胞 SAC 蛋白水平的转录后或转录调节知之甚少。
只有当所有着丝粒都形成稳定的端对端 MT 附着时，后期才能开始 。APC/C 的激活需要两个并行过程：从 APC/CCDC20–MCC 复合物中去除 MCC，以及防止 MCC 重新结合到游离的 APC/CCDC20上 。复合物存在封闭和开放两种构象状态，更开放的状态允许 MCCCDC20分子自泛素化，导致其降解和 MCC 解体 。APC/C 亚基 APC15 通过未知机制促进这种 “开放” 的 APC/C–MCC 状态 。
为防止释放的 MCC 重新结合到游离的 APC/CCDC上，MCC 必须被 AAA + ATP 酶甲状腺受体相互作用蛋白 13（TRIP13）分解 。TRIP13 与 MAD2 的 Hop1p–Rev7p–MAD2（HORMA）结构域结合，并在封闭 MAD2 的结构模拟物、衔接蛋白 p31comet的帮助下，将 MAD2 从封闭形式重塑为开放形式 。TRIP13 只有在 APC/CCDC20通过自泛素化机制从 MCC 中释放出来后才能发挥作用，这解释了未附着着丝粒可能产生的多余游离 MCC 是如何被降解的 。研究表明，MCC 分解过程中可能存在一个中间产物 BBC（BUBR1–BUB3–CDC20 组装体），在 SAC 阻滞期间，BBC 可以与 APC/C 结合并表现出显著的抑制作用，因此可能需要进一步分解 BBC 才能完全使 SAC 失活 。
由于在必要时（如附着错误校正期间）重新激活 SAC 需要 O-MAD2 构象体，缺乏 TRIP13 的细胞无法引发稳健的 SAC 响应 。这是因为在有丝分裂前核膜中缺乏足够水平的 O-MAD2 来进行 MCC 组装 。因此，TRIP13 的重塑活动似乎是无差错有丝分裂的关键机制，因为它促进了有效的 SAC 激活，从而确保后期及时开始。
靶向纺锤体组装检查点的激酶
持续的细胞增殖是癌症的主要特征之一，SAC 在这一过程中起重要作用 。开发抗癌药物的方法之一是延迟或阻止癌细胞增殖，如紫杉烷类药物通过激活 SAC 使细胞分裂周期停滞在有丝分裂期 。另一种方法是通过绕过 SAC 加速癌细胞增殖，导致染色体分离错误积累，最终使细胞死亡 。在寻找新的抗癌药物时，开发了几种针对参与 SAC 激活的激酶的小分子，以诱导癌细胞的染色体不稳定性（CIN） 。Aurora B 和 MPS1 是 SAC 抑制的主要靶点，有大量候选药物进入临床试验，但目前尚未有药物获得 FDA 或欧洲药品管理局（EMA）批准。
几乎所有已开发的 Aurora B 抑制剂都是 ATP 竞争性的，由于激酶之间的高度保守性，这些抑制剂可能存在脱靶效应，导致酶特异性差（即抑制其他激酶）和 / 或选择性差（即抑制 Aurora A 和 Aurora C） 。例如，Aurora B 抑制剂 barasertib（AZD1152）也抑制 Fms 样酪氨酸激酶 3（FLT3）和 KIT，这两种激酶在正常造血过程中起关键作用 。同时抑制 FLT3 和 KIT 会因 “合成致死毒性” 导致骨髓抑制，即两个对正常细胞功能至关重要的靶点同时缺失会导致细胞死亡，而单个靶点缺失细胞可以耐受 。
为克服这些限制，近期研究致力于开发变构 Aurora B 抑制剂 。Lakkaniga 等人开发了 SP - 92，这是一种有效的、非 ATP 竞争性的 Aurora B 抑制剂，对 FLT3 和 KIT 具有高选择性（超过 2000 倍） 。SP - 92 的开发始于从针对 Aurora B 的激酶定向片段库筛选中发现的一个命中化合物，经过迭代合成和酶学测定确定先导化合物 。天然化合物也可作为开发变构 Aurora B 抑制剂的灵感来源，Juillet 等人合成了苯并塞普汀的简化片段，鉴定出一种温和、相对选择性的非 ATP 结合 Aurora B 抑制剂（EL - 228），并在命中到先导化合物的优化过程中提高了其抑制效力和特异性（CJ2 - 150） 。
开发特异性激酶抑制剂的另一种策略是使用共价靶向方法 。虽然共价靶向曾因担心非特异性反应导致的脱靶效应而不受青睐，但现在又重新受到关注 。设计合理的共价抑制剂具有延长驻留时间、延长作用时间、通过非平衡结合实现完全靶点占据和高效力等优点 。Serafim 等人开发了首个针对 MPS1 的共价抑制剂 RMS - 07，该抑制剂靶向位于激酶中心铰链区域的一个保守性较差的半胱氨酸残基（Cys604） 。他们以可逆 MPS1 抑制剂 NTRC 0066 - 0 的化学结构为起点，引入丙烯酰胺弹头，使其能够以有利于共价结合的构
