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为解决抗体偶联药物（ADCs）研发中的复杂问题，研究人员开展其生物转化研究。通过多种体外系统及分析方法，明确了 ADC-1 和 ADC-2 的代谢产物、稳定性等。该研究有助于优化 ADCs 设计，提升研发效率。
在癌症治疗领域，抗体偶联药物（Antibody Drug Conjugates，ADCs）犹如一颗璀璨的新星，备受瞩目。它巧妙地将单克隆抗体的靶向能力与细胞毒性药物的强大杀伤力相结合，为攻克癌症带来了新的希望。然而，这颗新星的研发之路却充满了坎坷。
ADCs 的复杂性和多样性给其研发带来了巨大挑战。在设计 ADCs 时，需要考虑诸多因素，如连接子（linker）和有效载荷（payload）的选择、抗体的特性以及共轭位点的确定等。这些因素不仅影响着 ADCs 在体内的稳定性和疗效，还可能导致其在血液循环中出现过早释放有效载荷、形成无活性 ADCs 等问题，进而引发药代动力学 / 药效学（PK/PD）脱节。例如，某些连接子在血液循环中可能不稳定，导致有效载荷提前释放，不仅无法精准打击肿瘤细胞，还可能对正常组织造成损伤；而不合适的共轭位点则可能影响抗体的靶向性和药物的释放效率。此外，由于 ADCs 在生物系统中的复杂性和异质性，准确检测其成分和评估其稳定性也成为了一大难题。
为了突破这些困境，推动 ADCs 的发展，研究人员开展了一项重要研究。虽然文中未明确研究机构，但他们针对 ADCs 的生物转化进行了深入探究，旨在全面了解 ADCs 在体内的代谢过程、稳定性机制以及如何优化其设计，以提高治疗效果并降低毒副作用。
该研究取得了一系列重要成果，对 ADCs 的研发具有深远意义。首先，通过对 ADCs 生物转化的研究，明确了不同体外系统中有效载荷相关代谢产物的释放情况，为理解 ADCs 的作用机制提供了关键依据。其次，采用多种分析方法揭示了完整 ADCs 的生物转化过程，这有助于评估其在血液循环中的稳定性，为优化连接子和有效载荷的设计提供了方向。此外，研究中发现的物种特异性不稳定模式，能够帮助研究人员在临床前研究中更准确地评估 ADCs 的安全性和有效性，提高从临床前模型到临床应用的可预测性，加速候选药物的优化进程，从而推动 ADCs 在抗癌治疗领域的广泛应用。该研究成果发表在《Drug Metabolism and Disposition》杂志上，进一步彰显了其在该领域的重要价值。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是高分辨质谱（HRMS）技术，利用其高分辨率和高灵敏度的特点，对 ADCs 及其代谢产物进行精准分析；二是采用多种体外系统，如人肝溶酶体、S9 组分和肿瘤细胞等，模拟体内环境，研究 ADCs 的生物转化过程；三是结合免疫捕获技术与亚基或肽分析，从多个维度评估 ADCs 的结构完整性，其中包括中间向下（middle-down）和自下而上（bottom-up）的分析方法。
下面详细介绍研究结果：
- 检测和表征 ADCs 在人肝溶酶体、S9 和肿瘤细胞孵育中的有效载荷相关代谢产物：研究人员在三种体外系统中对两种可裂解 ADCs（ADC-1 和 ADC-2）释放的有效载荷相关代谢产物进行了研究。结果发现，溶酶体由于含有丰富的蛋白酶，能够更高效地释放有效载荷。以 ADC-1 为例，溶酶体在 48 小时时 DXd 释放百分比达到 77.6%，而 S9 在 72 小时时仅释放 27.5%，肿瘤细胞在当前孵育浓度下释放的 DXd 较少，但细胞内的绝对浓度仍超过细胞外。此外，研究还检测到了除预期有效载荷外的其他代谢产物，如 M1（Gly-DXd）、M3（Pro-Cys-MC-GGFG-DXd）和 M5（Cys-MC-GGFG-DXd）等，这表明即使是设计好的可裂解 ADCs 也存在多个裂解位点。对于 ADC-2，其使用的 Val-Cit（VC）连接子在肝溶酶体和 S9 中表现出更高效和均匀的有效载荷释放，且 MMAE 是唯一可检测到的释放成分，在溶酶体中 6 小时内达到最大释放水平。
- ADCs 在人源和鼠源血浆中亚基的生物转化：ADCs 在血浆中的稳定性一直备受关注，因为其不稳定可能导致毒素提前释放，引发严重的安全问题。研究人员评估了 ADC-1（MC-GGFG-DXd）和 ADC-2（MC-VC-PABC-MMAE）在体外血浆中的稳定性。结果显示，ADC-1 在人源和鼠源血浆中孵育 168 小时后，DXd 的释放量分别仅为 2.8% 和 0.5%，看似稳定性较高。然而，进一步研究发现，ADC-1 在血浆中存在明显的去共轭现象，孵育 168 小时后，其药物抗体比（DAR）从 8 降至 3，这表明虽然游离 DXd 释放量低，但共轭有效载荷仍可能缺失，导致 ADC 稳定性与总抗体稳定性不匹配。同样的去共轭现象也在基于 MC-VC-MMAE 的 ADC 中出现，说明 MC 共轭物存在普遍的不稳定性。
- 通过自下而上方法研究人血浆中 ADC-1 连接子 - 有效载荷的特异性生物转化：为了确定质量位移为 + 18 Da 的成分是来自 MC 共轭物的琥珀酰亚胺水解还是有效载荷 DXd 的内酯环水解，研究人员采用免疫捕获和酶消化结合肽图谱分析的自下而上方法。他们优化了酶消化条件，选择了三个代表性的共轭肽进行研究。结果发现，对于 Pep1 和 Pep2，水解产物占主导，串联 MS/MS 分析证实了水解发生在 MC 琥珀酰亚胺环。而 Pep3 则同时存在水解和去共轭现象，且约 80% 的 ADC 去共轭发生在重链上，轻链上极少。该方法能够识别细微的生物转化产物并精确绘制修饰位点，为了解 ADC-1 的降解机制提供了重要信息。
- 应用共轭肽生物转化评估 ADC-2 的物种差异：VC 连接子在临床批准的 ADCs 中广泛应用，但其在不同物种血浆中的稳定性存在差异。研究人员利用中间向下和自下而上的分析方法评估了 ADC-2 中 VC 连接子的稳定性。中间向下质谱分析虽能发现去共轭和水解降解产物，但由于低丰度代谢产物的质量位移灵敏度有限，无法区分物种间的生物转化差异。而自下而上的肽图谱分析则能够在肽水平检测到 VC 连接子的裂解产物，并确定其位点特异性生物转化，证实了 Ces1c 介导的裂解仅在鼠源血浆中发生，为种属依赖性连接子不稳定性提供了直接实验验证。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，ADCs 的连接子在维持系统稳定性和控制有效载荷释放方面起着关键作用。在药物研发阶段，评估有效载荷的释放机制和效率至关重要，这不仅涉及到有效载荷的递送速率，还关乎 “副产物” 的生成量。不同的体外系统各有优劣，溶酶体系统虽能高效释放有效载荷，但可能简化了细胞内的动态过程；肿瘤细胞研究虽更接近体内实际情况，但受 ADC 细胞毒性限制，难以进行高通量筛选；S9 组分则保留了更广泛的酶活性，能更好地模拟某些连接子在肿瘤细胞中的释放情况，对于早期发现新型连接子或有效载荷具有重要价值。
此外，ADCs 在血液循环中的稳定性仍是研究的重点。常用的可裂解连接子虽有助于有效载荷的递送，但也增加了在循环中被裂解的风险。仅通过量化血浆中释放的有效载荷来评估连接子稳定性可能并不全面，还需综合考虑 DAR 变化、连接子 / 有效载荷修饰等因素。自下而上的方法在解决更细微的生物转化问题上具有独特优势，但该方法的开发和数据集解析相对复杂。当不同定量方法显示出不匹配的 PK 谱时，需结合完整蛋白质或亚基分析来计算 DAR 和评估质量位移；若未发现明显生物转化，则可采用基于共轭肽的精确分析。
综上所述，该研究通过基于 LC-HRMS 的评估方法，全面深入地研究了 ADCs 的生物转化过程，为 ADC 的设计参数优化，如连接子化学、有效载荷选择和抗体工程等，提供了重要依据。同时，通过识别物种特异性不稳定模式，有助于进行临床前风险评估，提高了临床前研究到临床应用的可预测性，对推动 ADCs 的发展具有重要意义。
