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这篇综述聚焦药物性肝损伤（DILI），介绍了多种体外肝脏模型，包括细胞来源、培养方法、DILI 机制、新型生物标志物等。探讨了模型面临的挑战，虽目前模型无法完全替代动物实验，但随着研究深入有望更好监测药物毒性。
1. 引言
肝脏是人体最大的器官，约占成人体重的 2%。它在代谢、解毒等方面起着关键作用，但也极易受到药物毒性的影响，“肝毒性” 是药物研发过程中药物失败的主要原因之一。每年全球约有 200 万人因肝脏疾病死亡，约占总死亡人数的 4%。
实验动物广泛用于药物、化学品等的临床前安全性评估，但由于种属差异，动物实验结果难以准确预测人体反应，许多药物在动物实验通过后仍可能对人体肝脏造成损害。同时，动物实验的伦理问题也引发了广泛关注，因此开发具有更好预测能力的体外模型十分必要。
传统的二维（2D）培养系统虽简单方便，但无法长期维持肝细胞的复杂功能，限制了其在 DILI 检测中的应用。三维（3D）模型如球体和类器官能更好地模拟体内生理环境，在提高 DILI 预测准确性方面发挥着重要作用，但目前仍难以完全复制肝脏的所有功能。
2. 球体或类器官模型
3D 体外模型（如球体和类器官）在毒理学研究中受到广泛关注。类器官通过细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用自组织形成，能重现天然组织的关键结构和功能，可来源于多能干细胞、体细胞祖细胞或终末分化细胞。
2.1 永生化细胞系衍生的类器官（HepG2/HepaRG）
HepG2 是一种永生化人肝癌细胞系，具有成本低、增殖能力强等优点，常用于药物发现筛选的早期阶段。但其 I 相代谢酶（细胞色素 P450：CYP）和 II 相酶（UDP - 葡糖醛酸基转移酶：UGT、磺基转移酶：SULT）活性较低，限制了其在药物代谢物毒性测试中的应用。HepG2 球体通过 3D 培养，肝功能标记物表达显著增加，生理功能和代谢能力得到改善，可用于预测长期肝毒性。
HepaRG 细胞系在二甲基亚砜（DMSO）处理后可自发分化为肝细胞和胆管细胞，其 I 相和 II 相酶及转运体表达水平与原代人肝细胞（PHH）相当，在代谢研究方面表现优于 HepG2 细胞。但 HepaRG 细胞成本高、培养时间长，在检测肝毒性药物的细胞凋亡和坏死方面灵敏度较低。3D 培养可增强其肝细胞分化并延长功能维持时间，HepaRG 球体代谢酶表达水平与 PHH 相当，是保留关键肝功能的有前途的工具。然而，HepG2 和 HepaRG 均存在供体多样性受限的问题。
2.2 原代人肝细胞衍生的类器官
PHH 被认为是创建体外肝脏模型的金标准，具有供体多样性等优势，但在分离过程中易发生去分化和间充质转化，极性和功能迅速下降，主要用于短期急性毒性测试。3D 培养可恢复 PHH 的细胞活力、转录组、蛋白质组、代谢组表型和功能，但 PHH 生长停滞，难以大规模获得，且存在批次间差异和供体多样性不足的问题。
为解决这些问题，研究人员尝试通过添加生长因子等方法扩增成熟肝细胞，如 Hu 等人发现添加 R - spondin 可使肝细胞类器官在 ECM 穹顶中传代。此外，化学重编程 PHH 为增殖祖细胞的方法也在探索中，这些祖细胞可进一步分化为肝细胞和胆管细胞，且增殖效率显著提高，但重分化肝细胞的代谢酶水平仍低于 PHH。
人源化肝脏嵌合小鼠可作为研究药物代谢的优秀替代模型，其体内的人肝细胞功能可模拟人体肝脏。从人源化肝脏小鼠分离的肝细胞（如 PXB 细胞和 HepaCur?细胞）在商业上可获得，有望解决 PHH 稳定供应的问题，但仍存在获取源细胞困难和供体多样性不足的问题。
2.3 多能干细胞衍生的类器官
胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）具有高增殖和分化能力，在药物筛选和毒性测试中具有潜在应用价值。iPSCs 可从供体组织（如皮肤或血液）建立，解决了 PHH 和癌细胞系供体多样性的限制，且避免了 ESCs 的伦理问题。
人 ESCs 或 iPSCs 向肝细胞分化的方案已较为成熟，一般包括确定内胚层、后前肠、肝母细胞和肝细胞样细胞四个主要阶段。但 PSC 衍生的肝细胞通常不成熟，更类似于胎儿肝脏细胞，如表达较高水平的胎儿肝酶 CYP3A7。不过，其具有人特异性酶特征，可用于预测胎儿药物反应和评估成人药物代谢，但代谢活性仍低于 PHH，需要更成熟的模型用于药物研究。
3. 培养方法
为更好地模拟体内条件，研究人员开发了多种培养方法，各有优缺点。
3.1 三明治培养
三明治培养是广泛用于维持原代肝细胞功能和支持其长期代谢功能的技术。细胞在细胞外基质（ECM）材料（如胶原凝胶或 Matrigel）层之间培养，可增强肝细胞功能，恢复细胞极性，促进胆管形成。但该方法依赖高成本的 PHH，存在供体或批次差异导致的可重复性问题，且 PHH 在培养两周后 I 相药物代谢酶活性显著下降，不适合中长期重复毒性研究。在 PHH 单培养中，稳定形成扩张胆管仍具有挑战性，需与基质细胞共培养。iPSC 衍生的肝细胞经长期培养后进行三明治培养，可形成功能良好的胆管结构，有望克服 PHH 的一些问题。
3.2 与非实质细胞共培养
非实质细胞（NPCs）包括窦状内皮细胞、枯否细胞等，可支持肝细胞的生长和存活。NPCs 在肝脏细胞总数中占比约 40%，体积占比约 6.5%。3D 细胞共培养系统能更好地复制肝脏窦状结构，提供更相关的肝脏样环境和表型，在预测药物性肝毒性、肝脏药物代谢和药物相互作用方面具有优势，但准确复制体内空间组织和细胞 - 细胞相互作用仍具有挑战性。
3.3 微图案共培养（MPCC）
微图案共培养将原代大鼠或人肝细胞接种在胶原包被的圆盘上，周围环绕 3T3 - J2 小鼠成纤维细胞。该方法可维持不同细胞间的稳定比例和数量，在保持肝细胞表型和肝脏特异性功能方面表现出色，可用于预测药物毒性、相互作用等，在药物开发中具有重要应用价值。iPSC - HH - 基于微图案共培养（iMPCC）解决了 iPSC 衍生细胞功能不成熟的问题，在药物毒性测试中检测灵敏度和特异性与现有 PHH - MPCC 模型相当。
3.4 基于细胞插入物的培养
基于细胞插入物的培养利用多孔膜将肝细胞与非实质细胞物理分离，模拟肝脏的三维结构，如肝窦结构，膜可模拟 Disse 间隙。该方法可研究肝脏中的非接触细胞通讯，还可重现肝脏与其他器官的相互作用，已发展为微生理系统（MPS），如器官芯片和人体芯片。
3.5 肝脏芯片
肝脏芯片系统通过控制微流控芯片内的流体流动来模拟肝脏的生理环境。芯片通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）、玻璃或树脂等材料制成，包含多个由多孔膜分隔的通道，可放置不同类型的肝脏细胞。该系统能复制人类相关的代谢状态和细胞反应，用于模拟多种肝脏疾病，但使用 PDMS 等材料存在气体和溶液渗透性及对低分子量化合物吸附的问题。
4. DILI 作用机制
在体外细胞实验中，选择作为毒性指标的训练化合物至关重要，需涵盖已知机制定义的肝毒性。LiverTox 数据库提供了药物肝损伤相关数据，但信息质量参差不齐。目前认为药物可通过多种机制导致肝损伤，几个联盟推荐选择对应肝细胞损伤五个关键机制的特定训练化合物及阴性对照，以验证体外模型预测人类药物性肝损伤（DILI）的相关性。
4.1 机制 1：化学反应性代谢物（CRM）
药物代谢包括 I 相反应（如 CYP 酶催化的水解和氧化还原反应）和 II 相反应（与谷胱甘肽或葡萄糖醛酸结合），使药物转化为更易排泄的代谢物。但部分代谢物可能生成化学反应性代谢物（CRM）或不稳定结合物，CRM 可与细胞内的蛋白质、核酸和脂质等大分子反应，形成药物 - 蛋白质共价加合物，导致肝损伤。
4.2 机制 2：线粒体功能障碍
线粒体功能障碍不仅包括药物对线粒体功能的直接抑制，还涉及对 mtDNA、转录和蛋白质合成的干扰以及反应性代谢物造成的损伤。线粒体稳态改变可导致氧化应激、能量消耗、甘油三酯积累、膜通透性破坏、脂肪酸 β - 氧化（FAO）抑制和细胞死亡，进而引发肝损伤。多个靶点的损伤最终可能导致脂肪变性。
4.3 机制 3：溶酶体损伤
药物诱导的脂肪变性（脂肪肝）和磷脂沉积症是溶酶体储存障碍的类型，由阳离子两亲性化合物引发。溶酶体利用内部酶降解细胞内底物，并将产物输送到线粒体进行氧化。阳离子两亲性化合物进入溶酶体后质子化，与磷脂形成非共价复合物，难以被酶分解，导致磷脂在溶酶体中积累，引发磷脂沉积症。
4.4 机制 4：胆汁酸转运障碍
胆汁淤积是一种 DILI，特征是胆汁盐输出泵（BSEP）转运体受损，导致胆汁酸分泌障碍，细胞毒性胆汁酸积累、氧化应激和细胞死亡。BSEP 转运体负责将胆汁酸排泄到胆汁中，其功能障碍会引发一系列病理变化。
4.5 机制 5：免疫介导机制
免疫介导机制是剂量无关且不可预测的特发性药物性肝损伤（iDILI）的关键组成部分，与特定人类白细胞抗原（HLA）单倍型、其他免疫相关遗传因素和特征性临床特征密切相关。iDILI 的临床和组织学表型与特发性自身免疫性肝炎相似，炎症反应由肝脏驻留的非实质细胞和先天免疫细胞激活介导。损伤相关分子模式（DAMPs）和药物或其代谢物可激活先天和适应性免疫反应，这些反应可能导致其他肝损伤机制的发生。由于 iDILI 发病机制复杂，需采用基于机制的综合方法提高 DILI 预测的准确性。
5. DILI 的新型生物标志物
美国 FDA 长期使用 “Hy's Law” 识别可能导致严重肝毒性的药物并预测 DILI 风险，但目前 FDA 采用或验证的生物标志物数量有限。国家临床生物化学学会（NACB）和美国肝病研究协会（AASLD）推荐了用于临床前重复剂量毒性或安全性研究中识别肝损伤的指标，与识别人类肝损伤的指标相关。
然而，传统肝损伤生物标志物缺乏特异性和高灵敏度，在药物开发早期难以准确预测 DILI，且在体外模型中不常用。目前正在探索更有效的生物标志物，如循环 microRNAs（如 miRNA - 122、 - 192）、细胞角蛋白 - 18（CK18）、高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）和谷氨酸脱氢酶（GLDH）等。
5.1 microRNA - 122 和 microRNA - 192
microRNAs（miRNAs）是调节基因表达的小非编码 RNA。循环 miRNAs 在细胞外环境中稳定存在，可作为肝损伤的潜在生物标志物。miRNA - 122 和 miRNA - 192 在临床和体外研究中显示出比现有标志物更早检测到肝毒性或细胞死亡的潜力，在药物处理的体外模型中，其表达水平在细胞内下降，在培养上清液中升高。
5.2 细胞角蛋白 18
定量循环中全长细胞角蛋白 18 或半胱天冬酶切割的细胞角蛋白 18（ccCK18，CK18 片段）水平可反映肝细胞和胆管细胞的死亡和凋亡情况，在监测 APAP 肝毒性过程中的细胞死亡动态和作为预后指标方面具有重要意义。血清中这些标志物的水平与 DILI 密切相关，但目前在体外 DILI 模型中尚未见相关检测报道，不过在癌细胞系研究中已检测到其波动，推测在体外 DILI 模型中也可能检测到。
5.3 高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）
HMGB1 是一种具有多种功能的染色体蛋白，从受损肝组织释放后可诱导炎症反应。在 HepaRG 和 PHH 的二维培养中，暴露于对乙酰氨基酚（APAP）后，培养上清液中 HMGB1 水平呈浓度和时间依赖性增加，表明其可能作为体外肝脏模型中检测肝损伤事件的有用生物标志物。
5.4 谷氨酸脱氢酶（GLDH）
GLDH 是线粒体酶，参与谷氨酸转化为 α - 酮戊二酸和氨的过程。肝坏死或线粒体功能障碍时 GLDH 释放，被认为是肝脏线粒体损伤的生物标志物。在临床前数据中，GLDH 是多种药物诱导肝毒性的早期标志物，但它能否有效预测肝细胞坏死存在争议。在体外肝脏模型中，不同药物处理不同细胞系后，GLDH 水平在培养上清液中发生变化，但变化不一致。
6. 体外肝脏模型在 DILI 预测中的挑战
体外肝脏模型在预测 DILI 方面虽有进展，但目前仍难以完全替代动物实验。存在以下挑战：
6.1 实验模型缺乏标准化
现有动物模型虽不完美，但部分机制研究和评估参数相对标准化。而体外肝脏模型无法复制所有 DILI 机制，缺乏标准化评估指标，难以比较不同研究。因此，需为每种机制定义使用背景，开发通用基线模型，并建立按 DILI 机制分类的正负参考化合物及标准化暴露条件。
6.2 类器官模型批次内和批次间缺乏可重复性
2D 培养的细胞系或原代肝细胞模型可重复性高，而复杂 3D 结构的类器官模型由于组织架构和细胞多样性复杂，批次内和批次间可重复性较低，阻碍了其商业应用。可通过避免消耗类器官样本的终点评估，采用连续评估同一样本的方法来提高可重复性。
6.3 BME 使用导致的分化抑制
许多类器官模型使用基底膜提取物（BMEs，如 Matrigel）促进结构形成。Matrigel 成分复杂且批次间差异大，其主要成分层粘连蛋白 - 111 可维持干细胞未分化状态，阻碍胆管细胞和肝祖细胞向成熟肝细胞分化。
6.4 特发性 DILI（iDILI）和细胞源多样性
iDILI 发病率低，在小规模临床试验中难以检测，通常在 III 期临床试验或上市后才被发现，对药物开发构成重大风险。预测 iDILI 需考虑遗传背景、种族、性别和年龄等多样性因素，但传统细胞源（如 PHHs 和 HepG2 细胞）难以满足需求。多能干细胞虽有潜力，但衍生肝细胞不成熟，且重编程过程限制了对衰老因素的模拟，需探索延长培养时间、优化培养基等策略改进 iDILI 模型。
7. 结论
本文回顾了 DILI 的相关研究及体外模型的设计方法。目前体外模型预测 DILI 仍不可靠，增加模型复杂性虽能模拟体内环境，但也带来评估困难，且多数模型长期培养会发生表型改变，不适合非临床研究中的中长期重复毒性测试。不过，与早期相比，现有模型的准确性和预测性能已有显著提升，随着研究深入，有望开发出更好监测药物诱导毒性的模型。
