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本文聚焦于人类多能干细胞的研究，发现常规人类多能干细胞在非特异性抑制 tankyrase-PARP1 的条件下培养，可重编程为功能性卵裂球样干细胞（TIRN-SC）。该细胞具备独特的分化潜能，其机制涉及 PARP1 和 TNKS1/2 的调控，对理解胚胎发育及相关疾病研究意义重大。
TIRN-SC 的研究背景与意义
多聚 ADP - 核糖聚合酶（PARP）家族中的 PARP1 和端锚聚合酶（TNKS/TNKS2；PARP5a/5b）在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，它们通过催化和非催化功能调节基因组和蛋白质组，对胚胎发育的多个环节产生影响。此前研究表明，化学抑制 PARylation 或相关蛋白功能缺失会损害胚胎植入前的发育，而利用化学 PARP 抑制可在一定程度上扩展细胞的功能多能性。在此基础上，研究人员发现通过特定的化学重编程系统可将常规人类多能干细胞（hPSCs）转化为 tankyrase/PARP 抑制剂调节的幼稚干细胞（TIRN-SC），但 TIRN-SC 分化潜能改善的机制尚不清楚。本研究旨在深入探究 TIRN-SC 的特性、重编程机制及其在胚胎发育研究中的意义。
TIRN-SCs 表达人类卵裂球阶段特异性的转录和蛋白质组特征
研究人员采用两步 TIRN 重编程方法，将多种常规的起始态 hPSCs 高效转化为具有高功能多能性的 TIRN-SCs。对多个 TIRN-SC 系的研究发现，它们能稳定地获得激活的磷酸化 STAT3 信号、幼稚外胚层特异性转录本，同时降低 ERK1/2 磷酸化水平，并上调 TNKS1/2 蛋白表达，且这些特征至少能维持 30 代。
通过比较 8 个生物学独立的 TIRN 重编程的人类胚胎干细胞（hESC）和诱导多能干细胞（hiPSC）系与其同基因起始态对应物的转录组，发现 TIRN-SCs 显著差异过表达卵裂球阶段特异性的转录调节因子和先驱因子，这些因子涵盖了从合子基因组激活（ZGA）前到桑葚胚的胚胎阶段。例如，TIRN-SC 系不仅表达预期的幼稚外胚层特异性基因，还同时高表达数百种 ZGA 前 2C - 4C 特异性、8C - 桑葚胚特异性以及前谱系桑葚胚 / 内细胞团（ICM）特异性基因。
进一步通过蛋白质组分析，证实了 TIRN-SCs 中多种发育上不同谱系因子的同时表达，如幼稚外胚层特异性蛋白、4C - 8C 特异性蛋白、原始内胚层（PE）谱系特异性蛋白以及滋养外胚层（TE）谱系特异性蛋白等，这些蛋白通常仅在胚胎前谱系桑葚胚阶段共表达。这表明 TIRN-SCs 具有独特的转录和蛋白质组特征，类似于人类卵裂球 - 桑葚胚胚胎的特征。
瞬时、诱导性 DUX4 表达增强了 TIRN-SCs 的卵裂球样基因和蛋白质特征
虽然 TIRN-SCs 组成性地过表达数百种 4C - 8C 特异性 DUX4 靶基因，但其他已知的 DUX4 靶基因表达存在差异。为了探究 DUX4 对 TIRN-SC 表型的影响，研究人员构建了从同基因起始态 hPSCs 和 TIRN-SCs 诱导表达的全长 DUX4（iDUX4）细胞系。
对不同细胞系进行批量 RNA 测序和全蛋白质组学分析后发现，iDUX4 表达在 12 - 24 h 时可使部分 8C - 桑葚胚特异性 DUX4 靶基因在存活的细胞系中差异上调。在 TIRN-SCs 中，iDUX4 显著增强了 8C - 前谱系 ICM 特异性转录本和蛋白质的表达，这些原本在 TIRN-SCs 中已组成性表达的分子，在 iDUX4 作用下表达进一步提升。此外，iDUX4 还激活了一组额外的 8C 特异性 DUX4 靶基因。
通过主成分分析（PCA）发现，TIRN-SCs 在转录组上是一类独特的人类干细胞，与已报道的幼稚 hPSCs 和人类全能细胞转录组有明显区别。这表明 iDUX4 能增强 TIRN-SCs 的卵裂球样特征，进一步揭示了 TIRN-SCs 的独特性及其在胚胎发育研究中的潜在价值。
单个 TIRN-SC±iDUX4 表达跨越卵裂球到 ICM 特异性阶段的混合转录程序
批量 RNA 测序和蛋白质组学研究显示，未分化的 TIRN-SCs 和 TIRN-SC + iDUX4 细胞中存在同时表达的、谱系不同的 2C - ICM 转录程序。为了探究这些细胞群体是否存在异质性，研究人员进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。
结果表明，单个未修饰的 TIRN-SCs 和 TIRN-SC + iDUX4 细胞群体在转录上具有高度相似性，它们不仅共表达核心多能性和幼稚外胚层特异性基因，还共表达谱系特异性先驱因子。而且，在同一单细胞 TIRN-SC 群体中，能检测到 2C - 4C 特异性、8C 特异性、TE 特异性和 PE 特异性先驱因子与核心因子（NSO）的共表达，并且这些基因的表达在 TIRN-SC + iDUX4 单细胞群体中进一步增强。
通过对单细胞数据的分析，研究人员发现 TIRN-SC +/?iDUX4 群体作为一个复合群体，总体上激活了混合的 2C - 4C、8C、桑葚胚和 E5 - E7 ICM 阶段特异性转录程序，尽管各阶段基因表达强度存在差异。部分 TIRN-SCs 表达 4C - 8C 基因 TPRXL，且 iDUX4 激活后能增强 4C - 8C - 桑葚胚特异性因子的共表达。此外，通过与已发表的 scRNA-seq 数据整合分析发现，TIRN-SCs 在转录上与幼稚或 8C 样（8CLC）细胞不同，且部分 TD 细胞与受精卵 - 8C 细胞在聚类分析中紧密相关，支持了 TIRN-SCs 具有中间 / 混合激活的共享受精卵 - 8C 基因程序的观点。
向小鼠囊胚注射 TIRN-SCs 可高效生成人鼠嵌合胎儿
为了研究 TIRN-SCs 在体内的发育潜能，研究人员将表达 GFP / 嘌呤霉素抗性（puroR）和 tdTomato/puroR 基因的 TIRN-SCs 注射到 E3.5 小鼠囊胚中，并移植到假孕雌性小鼠体内。
通过多种方法对嵌合胎儿进行评估，结果显示在 E7.5 阶段，通过流式细胞术分析发现 5% - 30% 的 GFP + 细胞来源于人类 TIRN-SC，且与 GFP + 小鼠胚胎干细胞（mESC）注射的对照组相比，TIRN-SC-GFP + 表达不仅出现在外胚层，还出现在嵌合胚胎的外胚层和胚外外胚层 / 外胎盘锥区域。在 E9.5 和 E14.5 阶段，虽然大部分 GFP + TIRN-SC 注射的小鼠囊胚发育出正常的胎儿形态，但仍有 16% - 18% 的胚胎出现形态异常或生长迟缓。通过敏感的人类线粒体基因组 DNA PCR 分析，发现 22% 的 E9.5 胚胎和 27% 的 E14.5 胚胎含有人类 DNA 序列，且部分胚胎还表达人类 GAPDH 转录本。
进一步对 E9.5 胚胎进行共聚焦显微镜分析，发现 38% 的胚胎在多个组织中存在人类特异性表达的 HNA，包括神经组织等。在 E12.5 和 E14.5 胎儿肝脏或头部组织的培养中，也成功筛选和扩增出了人类细胞。这些结果证实了 TIRN-SCs 在体内具有高效的多谱系胚胎嵌合潜能。
TIRN-SCs 生成具有体内胎盘嵌合潜能的自我更新人类滋养层干细胞系
为了评估 TIRN-SCs 的胚外潜能，研究人员利用既定方案从 TIRN-SCs 生成了人类滋养层干细胞（hTSCs）。这些 hTSCs 具有自我更新能力，能稳定表达 CDX2、GATA3，且 NANOG 阴性，克隆效率较高。
将单个 tdTomato + 表达的 hTSCs 注射到 8C - 16C 小鼠胚胎中并移植到假孕雌性小鼠体内后，发现 hTSCs 能快速整合到小鼠囊胚的 TE 中，并高效地仅对 E7 胚胎的胚外外胎盘锥做出贡献。这表明 TIRN-SCs 具有较高的胚外嵌合潜能，为研究胎盘发育等相关领域提供了新的模型。
TIRN-SCs 直接且均等地向嵌合胎儿的胚胎和胚外部分分化；小鼠 E - 钙粘蛋白转基因增强 TIRN-SC 的组织靶向性
为了验证 TIRN-SCs 是否能像卵裂球一样直接向胚胎和胚外谱系分化，研究人员将单个 Hoechst 标记的 TIRN-SCs 或表达小鼠 E - 钙粘蛋白（mE-Cad）/mCherry ± tdTomato 转基因的 TIRN-SCs 注射到 8C - 16C 小鼠胚胎中。
通过共聚焦荧光显微镜观察发现，单个 Hoechst + TIRN-SC +/?mE-Cad 能在小鼠囊胚中增殖，并直接且均等地整合到小鼠 ICM 或 TE 中，且 TIRN-SCs 和 TIRN-SC + mE-Cad 在整合效率上没有显著差异。在 E11.5 胎儿和胎盘组织中，也能检测到人类 tdTomato + 细胞，且 TIRN-SC + mE-Cad 组中人类细胞更频繁地靶向到小鼠胎儿肝脏（FL）和主动脉 - 性腺 - 中肾（AGM）器官。这些实验表明 TIRN-SCs 在体内具有类似卵裂球的功能，能直接且均等地向胚胎和胚外组织分化，而 mE-Cad 转基因可增强其组织靶向性。
TIRN-SCs 在 ADP - 核糖基化活性方面存在全球缺陷，表达异常的 TNKS1/2 和 PARP1 蛋白水平，并过表达数百种 PARP1 调节的发育基因
之前研究发现 XAV939 处理小鼠 1C 胚胎会使其发育停滞在 ZGA / 全能 2C 阶段，且基因缺陷的 PARP1?/?敲除 mESCs 会解除对许多在 TIRN-SCs 中过表达的多谱系特异性因子基因的抑制。本研究中，TIRN-SC +/?iDUX4 相对于起始态 hPSCs 表达增加的 TNKS1/2 和减少的 PARP1 蛋白水平，可能重置了 TNKS/PARP1 平衡，模拟了 XAV939 在小鼠 1C 胚胎或 PARP1?/? mESCs 中的作用。
通过对 TIRN-SCs 中 PARP1 和 TNKS1/2 的表达、活性及靶点的评估发现，TIRN-SCs 稳定了已知 TNKS 底物的蛋白质表达，并调节了活性非磷酸化 β - 连环蛋白的亚细胞分布。而且，TIRN-SCs 在 ADP - 核糖基化方面存在全球缺陷，不仅 PARP1 非 ADP - 核糖基化，且所有 PAR 和单 ADP - 核糖基化（MAR）活性均降低。在 DNA 损伤应激条件下，TIRN-SCs 能激活基因组稳定的 DNA 损伤反应（DDR）机制，同时抑制 PARP1 和 TNKS 介导的 PAR 催化。这些结果表明 TIRN 重编程是由 TNKS/PARP1 蛋白比例失衡驱动的，且 TIRN-SCs 保留了这些重要 PARP 的 DDR 基因组保护活性。
全基因组范围内 NSOP 结合位点在谱系特异性基因的 DUX4 可及增强子处的重编程确定了潜在的全能性调节染色质
PARP1 与核心 NSO 多能性因子合作调节谱系特异性发育程序。研究人员比较了 TIRN-SC 和起始态 hPSC 中 PARP1、NANOG、SOX2、OCT4 的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）结合谱以及组蛋白标记的占用情况，发现 TIRN-SC 染色质中 PARP1 和 NSO 存在显著的全基因组重排。
在 TIRN-SCs 中，PARP1 在全基因组的富集总体下降，而 NANOG 和 SOX2 的结合位点数量显著增加。整合 TIRN-SC 中获得的 NSO 位点与 DUX4 ChIP-seq 数据发现，重编程的 TIRN-SC NSO 位点集中在 DUX4 可及的染色质区域。其中，最显著差异结合的 NSO 共结合区域定义了一组 2552 个 DUX4 可及位点，这些位点富含 H3K27ac 占据的近端和远端增强子，且与起始态细胞相比，TIRN-SCs 中这些区域的 PARP1 富集度更高。
这些 NSOP-DUX4 区域转录活跃，其调控的基因包括 2C - 4C、8C 和 ICM 谱系特异性因子，且 iDUX4 激活后这些基因的表达增强。通过将 TIRN-SC 获得的 NSO - PARP1 - DUX4 峰映射到已发表的人类胚胎细胞染色质可及性数据，并进行从头序列基序分析，发现这些区域显著富集了数百种多谱系、发育先驱转录因子的组合共结合基序，这些因子参与调节 ZGA、外胚层、TE、PE、确定内胚层、外胚层和中胚层的规范。这表明 TIRN-SCs 中存在全基因组范围的 NSOP-DUX4 可及区域重塑，可能调节全能性（胚胎和胚外）转录程序。
全球范围内 TNKS/PARP1 蛋白底物的 ADP - 核糖基化减少驱动了发育调节因子的泛素组重编程
鉴于 PAR 缺陷的 TIRN-SCs 中谱系调节因子的染色质结合发生了重编程，研究人员推测细胞 ADP - 核糖基化的全球关闭和 PARP1 水平的降低可能对 PAR 依赖的泛素化（PARdU）相关的染色质机制产生深远影响。
通过对同基因起始态和（PAR 耗尽）TIRN-SC +/?iDUX4 进行全蛋白质组和翻译后泛素
