揭秘非小细胞肺癌奥希替尼耐药 “元凶”：长链非编码 RNA LRTOR 的关键作用

奥希替尼（OSI）治疗 EGFR 突变肺癌时会出现耐药问题，机制不明。研究人员开展了关于长链非编码 RNA LRTOR 在非小细胞肺癌（NSCLC）奥希替尼耐药中作用的研究。结果发现 LRTOR 可驱动耐药，或可成为治疗和预后新靶点。

　　肺癌，这个 “癌症杀手” 在全球范围内横行无忌，尤其是非小细胞肺癌（NSCLC），严重威胁着人们的生命健康。随着医学研究的深入，针对携带表皮生长因子受体（EGFR）突变的 NSCLC 患者，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）带来了新的希望。然而，肿瘤细胞却十分狡猾，它们逐渐产生了耐药性，使得这些治疗手段的效果大打折扣。奥希替尼（OSI）作为第三代 EGFR-TKI，虽然在疗效上更胜一筹，但耐药问题依旧不可避免，而且约 50% 患者耐药的机制尚不明确。在这样的困境下，深入探究奥希替尼耐药机制、寻找新的治疗和预后靶点迫在眉睫。

为了解决这一难题，中山大学附属第五医院和澳门大学的研究人员展开了深入研究。他们发现了一种新型长链非编码 RNA（lncRNA）——LRTOR，它在奥希替尼耐药过程中扮演着关键角色。这一研究成果发表在《Drug Resistance Updates》上，为攻克奥希替尼耐药问题带来了新的曙光。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过 RNA 深度测序筛选出与奥希替尼耐药相关的 lncRNAs；接着，采用细胞实验，如细胞活力测定、细胞周期和凋亡检测、Transwell 实验等，探究 LRTOR 对细胞功能的影响；同时，构建细胞衍生的异种移植（CDX）小鼠模型和患者来源的类器官异种移植（PDOX）小鼠模型，从体内实验层面验证 LRTOR 的作用；此外，还运用 RNA pulldown - 质谱、RNA pulldown - Western blot、RNA 免疫沉淀（RIP）等技术，明确 LRTOR 与相关蛋白的相互作用关系 。研究样本队列来源为中山大学附属第五医院收集的奥希替尼敏感和耐药组织活检样本。

下面来看看具体的研究结果：

• LRTOR 与奥希替尼耐药患者预后的关系：研究人员用不同浓度的奥希替尼处理 NSCLC 细胞系，构建耐药细胞模型。通过 RNA 测序筛选出 lncRNA4217，即 LRTOR，其在耐药细胞系中表达上调。经多种算法分析，确定 LRTOR 为非编码 RNA，且主要定位于细胞质。对比临床标本发现，奥希替尼耐药组织中 LRTOR 表达更高，而且高表达 LRTOR 的患者总生存期更短，表明 LRTOR 与奥希替尼耐药相关，可作为独立预后因子。
• LRTOR 诱导奥希替尼耐药的体内外研究：在体外实验中，敲低 LRTOR 可抑制耐药细胞活力和增殖，使细胞对奥希替尼重新敏感，促进细胞周期停滞和凋亡，抑制细胞迁移和侵袭，并改变上皮 - 间质转化（EMT）和癌细胞干性相关蛋白表达。而过表达 LRTOR 则使敏感细胞对奥希替尼产生耐药性。在体内实验中，构建的 CDX 小鼠模型显示，敲低 LRTOR 可抑制肿瘤生长，增强奥希替尼的抗肿瘤效果；过表达 LRTOR 则促进肿瘤生长，使肿瘤对奥希替尼耐药。
• LRTOR 与 YAP 相互作用促进奥希替尼耐药：研究发现 LRTOR 主要在细胞质中，且不太可能作为竞争性内源性 RNA（ceRNA）发挥作用。通过 RNA pulldown - 质谱等技术，证实 LRTOR 与 Yes 相关蛋白（YAP）相互作用，二者结合区域为 LRTOR 的 1 - 600nt，YAP 的 TEAD - BD 和反式激活结构域参与结合。临床标本分析显示，奥希替尼耐药组织中 YAP 富集，且 LRTOR 与 YAP 表达正相关，表明 YAP 参与 LRTOR 诱导的奥希替尼耐药。
• LRTOR 对 YAP 磷酸化位点的影响：检测发现奥希替尼耐药细胞中总 YAP 水平高，而 Ser¹²⁷和 Ser³⁸¹位点磷酸化的 YAP 水平低。敲低 LRTOR 可增加 YAP 在这两个位点的磷酸化，降低总 YAP 水平；过表达 LRTOR 则相反。此外，LRTOR 还影响 YAP 的核定位和稳定性，突变 LRTOR 的 loop A 和 loop B 结构，可影响 YAP 的磷酸化和核定位，说明 LRTOR 可掩盖 YAP 的磷酸化位点，增强其稳定性和核转位。
• LRTOR 与 KCMF1 结合促进奥希替尼耐药：RNA pulldown 和 RIP 实验表明，LRTOR 与钾通道调节因子 1（KCMF1）结合，结合序列为 2135 - 2735nt，LRTOR 与 KCMF1 的 C2H2 结构域结合，二者在细胞质中共定位。虽然 KCMF1 表达不受 LRTOR 影响，但敲除 KCMF1 可抑制细胞增殖和转移，减轻 LRTOR 过表达带来的影响，说明 KCMF1 参与 LRTOR 诱导的奥希替尼耐药。
• KCMF1 介导的 K63 连接的泛素化促进 YAP 核转位：实验发现 KCMF1 主要促进 YAP 的 K63 连接的泛素化，敲除 KCMF1 可降低奥希替尼耐药细胞中 YAP 的 K63 泛素化水平。LRTOR 可促进 KCMF1 与 YAP 的相互作用，进而促进 YAP 的 K63 泛素化和核转位，敲除 KCMF1 或敲低 LRTOR 可减少 YAP 与 TEAD 的结合，表明 KCMF1 在 LRTOR 依赖的方式下催化 YAP 的 K63 泛素化并促进其激活。
• YAP/TEAD1 复合物激活 LRTOR 转录：通过生物信息学预测和实验验证，发现 YAP/TEAD1 复合物可直接结合到 LRTOR 启动子的 TEAD1 结合位点，激活 LRTOR 转录，形成正反馈回路。
• 敲低 LRTOR 治疗奥希替尼耐药的治疗潜力：构建患者来源的类器官（PDOs）模型，发现高 LRTOR 表达的 PDOs 对奥希替尼联合 LRTOR 沉默更敏感。在 PDOX 小鼠模型中，敲低 LRTOR 可抑制高 LRTOR 表达的肿瘤生长，使肿瘤对奥希替尼重新敏感，且对小鼠体重无明显影响，表明 LRTOR 是治疗奥希替尼耐药 NSCLC 的有前景的靶点。

综合研究结论和讨论部分，该研究首次揭示了 LRTOR 在非小细胞肺癌奥希替尼耐药中的关键作用机制。LRTOR 通过抑制 YAP 的蛋白酶体降解、促进 KCMF1 介导的 YAP 的 K63 泛素化、推动 YAP 核转位，并形成 LRTOR - YAP 正反馈回路，放大 YAP 的致癌信号，从而诱导奥希替尼耐药。这一发现为理解奥希替尼耐药机制提供了新视角，也为临床治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌提供了潜在的治疗和预后靶点，具有重要的临床意义。不过，LRTOR 在癌症尤其是耐药方面还有更多功能等待进一步深入探索，未来的研究有望基于此开发出更有效的治疗策略，为肺癌患者带来更多希望。