编辑推荐：
这篇综述聚焦法布里病（FD），探讨内质网应激（ER stress）和未折叠蛋白反应（UPR）在其发病机制中的作用，介绍当前治疗手段如药物和化学伴侣疗法，还对未来研究方向提出展望，为 FD 研究和治疗提供了全面参考。
内质网应激和未折叠蛋白反应对法布里病的影响
摘要
法布里病（FD）是一种溶酶体贮积症，由 α - 半乳糖苷酶 A（GLA）基因的致病性错义或无义变异引起，导致酶活性缺失或降低。底物 Globotriaosylceramide 在溶酶体中积累，会引发进行性肾衰竭、伴有（恶性）心律失常和进行性心力衰竭的心肌病以及复发性中风，严重影响患者寿命。越来越多证据表明，致病性GLA错义变异和一些看似良性的GLA变异，会导致蛋白质在内质网（ER）中潴留，引发内质网应激，进而触发未折叠蛋白反应（UPR），导致细胞功能失调，包括炎症、不可逆细胞损伤和细胞凋亡。本综述旨在介绍内质网应激和未折叠蛋白反应在法布里病中的致病意义、当前治疗方法（包括药物和化学伴侣），并展望法布里病的现有研究和未来治疗方向。
引言
蛋白质稳态对细胞功能和存活至关重要。新合成的蛋白质在内质网中经伴侣辅助折叠成合适的三级结构后，才能转运到亚细胞靶点。但蛋白质折叠易出错，约 30% 新合成的蛋白质会错误折叠，细胞受应激、接触有毒成分或合成的蛋白质发生突变时，错误折叠频率更高。错误折叠的蛋白质常无功能，会聚集并滞留于亚细胞器，对细胞有毒性。高水平的错误折叠蛋白会引发内质网应激，与多种疾病发病相关，如 2 型糖尿病和神经退行性疾病。
法布里病是一种罕见的溶酶体贮积症，属于鞘脂类疾病，特征是溶酶体酶 α - 半乳糖苷酶 A（AGAL/GLA）缺乏，导致底物 Globotriaosylceramide（Gb3）降解受损。细胞内 Gb3逐渐积累，激活促炎和促纤维化信号通路，引发多系统疾病，损害重要器官。目前已发现超 900 种不同的GLA变异，包括错义突变，可导致 AGAL 蛋白错误折叠，诱导内质网应激。无义变异通常使翻译提前终止，导致蛋白缺失；而大多数错义GLA变异会产生不稳定、错误折叠的蛋白，降低 AGAL 活性。这些变异依表型可分为 “致病性”“可能致病性”“意义不明”“可能良性” 和 “良性” 五类。
经典法布里病多见于携带截短或错义GLA变异的男性，他们体内 AGAL 酶活性缺失，血浆 Globotriaosylsphingosine（lyso - Gb3）水平升高，细胞内有 Gb3包涵体。这类患者通常在儿童早期出现症状，30 - 40 岁时会出现心脏、肾脏和神经系统并发症。迟发型表型的男性患者携带错义GLA变异，AGAL 活性中度降低（为正常的 2 - 20%），血浆 lyso - Gb3轻度升高。与经典表型相比，迟发型表型发病较晚，常局限于心脏或肾脏疾病。对于基因变异意义不明的患者，目前缺乏足够数据判断其是否致病。
部分携带特定 AGAL 变异的患者，在鉴别诊断中会出现提示法布里病的临床表现，如神经性疼痛。但这些患者 AGAL 酶活性正常或仅轻微降低，细胞内无或仅有少量 Gb3包涵体，可排除法布里病诊断。内质网应激和未折叠蛋白反应可能在其中发挥重要作用。通常认为，错误折叠的蛋白无法通过内质网的质量控制机制，会在到达溶酶体前被提前降解。因此推测，某些错义 AGAL 变异可导致内质网应激和未折叠蛋白反应激活，引发细胞致病过程，且这一过程可能与残余 AGAL 酶活性无关。细胞培养实验中，突变 AGAL 过表达会导致内质网潴留和未折叠蛋白反应，支持了这一假设。
ER 应激和三条 UPR 通路
内质网是蛋白质生物合成和折叠的主要场所，能感知并应对错误折叠蛋白的积累，即内质网应激。需区分生理和病理内质网应激，生理状态下内质网控制蛋白质质量，而错误折叠蛋白过多等情况会引发病理内质网应激，导致疾病。细胞对内质网应激的复杂反应即未折叠蛋白反应，由三种内质网跨膜蛋白介导。
ATF6 介导的 UPR 信号通路
激活转录因子 6（ATF6）是内质网应激传感器，作为内质网膜结合转录因子发挥作用。当 ATF6 的内质网腔结构域识别到错误折叠 / 未折叠蛋白后，全长蛋白从内质网转移到高尔基体。在高尔基体中，它被蛋白酶切割成多个片段，其中有活性的胞质 ATF6α 片段会迁移到细胞核，诱导未折叠蛋白反应靶基因表达。产生的伴侣蛋白和酶（如 BiP、ERp57 和 PDIA6）在蛋白质折叠、分泌以及内质网 / 高尔基体生物合成中起重要作用，增强这些细胞器的分泌能力。其他上调的蛋白（如 GRp94）促进基于蛋白酶体的内质网相关蛋白降解（ERAD），有助于错误折叠蛋白的降解，维持内质网稳态。
IRE1 介导的 UPR 信号通路
肌醇需求酶 1α（IRE1α）是内质网跨膜蛋白，具有激酶和核糖核酸内切酶（RNase）双重酶活性。内质网应激时，IRE1α 寡聚化并发生自磷酸化，从而能够剪切转录因子 X - box 结合蛋白 1（XBP1）mRNA 中的内含子。剪切后的 XBP1 mRNA 翻译出有活性的 XBP1s，它转移到细胞核，增加 MDG1/ERdj4、IL - 6 和 EDEM1 等基因的表达，这些基因参与内质网蛋白的转运、折叠和分泌、炎症反应、内质网和高尔基体生物合成以及错误折叠蛋白的降解。长时间的内质网应激会导致调节性 IRE1 依赖的衰变（RIDD），即 IRE1α 切割 mRNA 或前体微小 RNA（miRNA），使其降解。这一过程可减少内质网中的 mRNA 丰度和相关蛋白折叠负荷，但也会使细胞信号向细胞凋亡转变，因为正常情况下抑制促凋亡基因的 miRNA 被消耗。此外，肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）家族成员可与 IRE1α 的胞质结构域结合，随后激活 NFκB 介导的炎症、自噬和应激反应。
PERK 介导的 UPR 信号通路
蛋白激酶 R 样内质网激酶（PERK）是内质网应激传感器，在错误折叠 / 未折叠蛋白积累时发生二聚化和反式磷酸化。其胞质激酶结构域磷酸化真核翻译起始因子 2 亚基 α（eIF2α），导致蛋白质合成暂时减弱。该机制可防止新合成的蛋白质进入内质网，减轻内质网的蛋白折叠负担。此外，eIF2α - P 信号会上调一系列蛋白，包括激活转录因子 4（ATF4），进而促进 CHOP 或 GADD34 等基因的表达，这些基因参与氧化还原稳态、氨基酸代谢、抗氧化反应、内质网蛋白合成和细胞凋亡。内质网应激解除后，为恢复蛋白质合成，ATF4 还参与负反馈回路，使 eIF2α - P 去磷酸化。
ERAD 激活和功能
内质网相关降解（ERAD）是清除内质网中未折叠和错误折叠蛋白的机制。清除并降解这些蛋白有助于防止内质网应激时错误折叠蛋白积累，减少未折叠蛋白反应。因此，ERAD 功能失调的细胞会持续激活未折叠蛋白反应。不过，ERAD 激活也可能对细胞产生负面影响，如囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的 ΔF508 变异，虽该变异产生的蛋白通常功能完整，但会被 ERAD 识别并提前降解，引发囊性纤维化。一般来说，错误折叠的蛋白会利用与内源性伴侣蛋白长时间结合、暴露的疏水区域或特定的 N - 连接寡糖结构等特征，生成所谓的降解标签，从而被靶向进行 ERAD。
内质网腔中的可溶性蛋白通常通过 HRD1 - E3 复合物进行逆向转运，而整合膜蛋白则经 ERAD 途径处理，被转运到内质网的胞质侧。这一步由 E3 泛素连接酶复合物的膜结构域介导。蛋白一旦暴露于内质网胞质侧，就会被泛素结合酶（E2 连接酶）泛素化。随后，胞质中的 Cdc48/p97 复合物结合泛素化蛋白，介导其从内质网膜中提取出来，最后被运送到胞质蛋白酶体进行最终降解。
法布里病中无义变异和错义变异的差异
GLA基因中的功能丧失变异（包括无义突变、剪接位点突变、缺失或插入）会导致内源性 AGAL 活性缺乏，引发法布里病，这是由于蛋白质合成提前终止。男性法布里病患者通常会出现 “经典” 的法布里病表型，早期出现典型症状，如胃肠道症状、神经性疼痛、少汗、血管角质瘤、耳鸣和角膜涡状浑浊。青春期时，这些患者会出现进行性多器官受累，影响肾脏、心脏和中枢神经系统。此外，他们几乎所有细胞 / 组织的溶酶体中都有 Gb3包涵体，血浆中 lyso - Gb3水平较高。
GLA基因中错义变异的生化效应更为多样。根据其在蛋白质中的位置，错义变异可能导致无效突变，使 AGAL 活性极低或无活性（如催化中心的突变），也可能仅使 AGAL 酶活性适度降低。前者通常也会导致 “经典” 的法布里病表型，而导致 AGAL 酶有残余活性的变异，可能引发 “迟发型” 表型，其特征是首次症状在 30 - 40 岁出现，主要表现为心脏症状，其他器官受累较轻，血浆 lyso - Gb3水平仅适度升高。研究较充分的导致心脏 “迟发型” 表型（如心脏功能不全、左心室肥厚和心律失常）的 p.N215S 变异，也被称为 “心脏” 变异。215 位氨基酸的改变导致糖基化缺失，而糖基化是通过甘露糖 - 6 - 磷酸受体正确转运到溶酶体所必需的。因此，大多数突变蛋白滞留在内质网，导致溶酶体中 AGAL 活性降低，同时引发内质网应激和未折叠蛋白反应。目前，尚不清楚法布里病中哪些 AGAL 变异会引发病理性内质网应激和未折叠蛋白反应，以及它们对临床表型的具体贡献。现有数据表明，内质网应激可能在法布里病发病机制中起重要作用，但难以将其直接影响与溶酶体功能障碍的继发后果区分开来。而且，根据现有认知，无法通过当前的表型（“经典型” 与 “迟发型”）推断底物积累（Gb3）或内质网应激的病理生理机制。
法布里病中潜在的 ER 应激和 UPR
内质网蛋白质稳态改变和未折叠蛋白反应信号通路参与多种人类疾病，如癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病。在法布里病（一种溶酶体贮积症）中，未折叠蛋白反应也可能发挥疾病介导作用。经典法布里病主要由溶酶体 AGAL 活性缺乏引起，但这无法完全解释非经典或迟发型表型以及法布里病变异的临床发现，因为部分患者虽有（显著）细胞内 AGAL 活性，且溶酶体中无或仅有少量 Gb3包涵体，但仍表现出法布里病样症状。无义变异通常导致翻译提前终止和随后的降解，而错义变异只是导致氨基酸替换。
AGAL 在内质网合成，经翻译后修饰加上甘露糖 - 6 - 磷酸（M6P），再通过分泌途径转运到溶酶体。特定的GLA变异可通过不同方式影响 AGAL 的合成、加工和稳定性。一些 AGAL 变异的错误折叠和被 ERAD 加速降解，与无义变异类似，会导致溶酶体酶缺乏，引发法布里病。相反，持续产生突变蛋白导致的慢性未折叠蛋白反应诱导，可能导致细胞死亡或炎症激活，在携带 AGAL 变异的患者中发挥病理作用，与其他疾病情况类似。但这在 AGAL 方面尚未得到充分研究，结果也存在争议。
此前一项研究分析了法布里病患者和对照者外周血单个核细胞中一些内质网应激标记物的表达水平，未发现明显差异。但该研究未提供相关 AGAL 变异信息，且分析的患者队列中可能包含错义变异和无义变异携带者，结果并不意外。相比之下，在表达两种 AGAL 变异（p.A156V 和 p.A285D）的果蝇模型中，证实了内质网潴留和未折叠蛋白反应激活。目前，多数分析不同 AGAL 变异定位的研究，基于在各种细胞培养模型（如野生型 COS - 1、COS - 7 或 HEK293，以及现在常用的 AGAL 缺陷型 HEK293T 细胞）中的人工异源表达。在 COS - 7 细胞中异源表达 p.R112C、p.C172G 和 p.G411D 会导致蛋白滞留在内质网，而良性变异 p.D313Y 能正确转运到溶酶体。在 AGAL 缺陷型 HEK293 细胞中异源过表达 8 种 AGAL 错义变异（p.R100T、p.D165V、p.D231N、p.N263S、p.A288D、p.M296I、p.R301Q、p.G360D）发现，有残余活性的变异（p.D231N、p.N263S、p.M296I、p.R301Q、p.G360D）与野生型相比，溶酶体定位减少，仅部分滞留在内质网；而无残余活性的错义变异（p.R100T、p.D165V、p.A288D）则完全滞留在内质网。仅表达 p.D165V、p.A288D 和 p.R100T 的细胞中 BiP 表达增加，p.G360D 和 p.R301Q 两种变异还激活了 ATF6 未折叠蛋白反应分支。对存在争议且可能为良性的变异 p.S126G 的研究也得到类似结果，在野生型 COS - 7 细胞中过表达该变异会导致内质网潴留和 PERK 未折叠蛋白反应分支激活。对 “心脏” 变异 p.N215S 的分析发现，它未在内质网滞留，原因可能是被泛素化后快速降解。但有趣的是，研究未考虑 AGAL 分泌增加（可在细胞培养上清液中检测到）的情况。若进一步考虑这一点，意味着表达该变异的细胞（及患者）不应有 AGAL 活性，然而 p.N215S 变异患者的细胞和体内确实存在可测量但降低的 AGAL 活性，研究人员未对这一矛盾结果进行讨论或结合文献分析。
最近一项病例研究分析了错义变异 p.N5D 的影响，该变异位于 AGAL 的信号肽（由前 31 个氨基酸组成）中。过表达突变蛋白会导致 BiP 表达增加、内质网形态损伤和溶酶体内包涵体形成，患者的外周血单个核细胞炎症信号增强。Zivna 及其同事发表了目前关于 AGAL 错误加工诱导内质网应激和未折叠蛋白反应最全面的研究。该研究分析了患者来源的成纤维细胞以及稳定或瞬时转染的 HEK293 细胞中几种错义 AGAL 变异的细胞内分布。结果发现，与经典和非经典法布里病相关的致病性变异（p.R112H、p.A135V、p.L294X、p.R301Q 和 p.R342Q）定位于溶酶体，并在肾活检中表现出特征性的生化异常和组织病理学改变。相比之下，与非经典、迟发型法布里病相关的错义 AGAL 变异（p.A97V、p.Q279E 和 p.M296I）或意义不明的变异（p.L394P、p.E66Q、p.R118C、p.A143T、p.R252T 和 p.D313Y）则定位于内质网。尽管存在一些局限性，该研究为法布里病和未折叠蛋白反应提供了新的基础见解，提出了 “AGALopathy” 这一有趣的新概念。AGALopathy 是指错误折叠的 AGAL 变异由于异常的细胞内潴留导致内质网功能障碍和致病性未折叠蛋白反应，它不同于基于酶缺乏导致细胞内 Gb3积累的法布里病，因此不能用酶替代疗法（ERT）成功治疗，未来还需更多研究来深入探讨这一概念。
目前多数研究数据需谨慎解读，部分研究未提供分析变异的 AGAL 活性，且实验设置多基于人工瞬时过
