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本文报道了一种新型铱 (III) 配合物，可将 Cu+靶向递送至三阴性乳腺癌（TNBC）细胞线粒体并成像，通过诱导 DLAT 寡聚化等机制增强铜死亡（cuproptosis）。体内实验显示其生物相容性良好，为癌症诊疗提供了新策略。
设计与合成发光性铜死亡诱导剂
过渡金属在生命系统中至关重要，但过量会造成损害。铜（Cu）富集可导致细胞程序性死亡，即铜死亡，这为抗癌提供了新策略。不过，目前铜死亡面临 Cu 递送和追踪难题。本研究设计并合成了一种基于铱 (III) 的配合物，用于解决这些问题。
该配合物包含特定的 N∧N 配体，能选择性结合 Cu+离子，避免了在细胞环境中将 Cu2+转化为 Cu+的步骤，有望增强铜死亡效果。同时，配合物中的环金属化铱 (III) 部分既作为线粒体靶向单元，又充当发光团，其环金属化 C∧N 配体可调节发射特性，适用于成像应用。
配合物 1 的合成采用收敛策略。首先，(3′ - 甲基 - [1,1′ - 联苯] - 3 - 基) 甲醇经 4 - 硝基苯基碳酰氯活化形成中间体 S1，S1 再与双 (吡啶 - 2 - 基甲基) 胺反应生成最终的 N∧N 配体 S2。与此同时，C∧N 配体 4 - 氯 - 2 - 苯基喹啉（Clpq）与水合氯化铱 (III)（IrCl3·xH2O）反应得到氯桥联的铱 (III) 二聚体。最后，配体 S2 与二聚体配位生成最终的配合物 1。所有中间体和配合物均通过1H - NMR、13C - NMR 和电喷雾电离质谱（ESI - MS）进行了充分表征，且配合物 1 的纯度经高效液相色谱测定超过 95%。
配合物 1 对 Cu+离子的特异性发光响应和高亲和力
研究人员首先对配合物 1 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的光物理性质进行了研究。配合物 1 在 300 - 400nm 处有强吸收带，归因于配体的 π - π?跃迁和单重态金属 - 配体电荷转移相互作用；在 400nm 以上有较弱吸收带，吸收峰约在 460nm，推测属于三重态金属 - 配体电荷转移（3MLCT）状态。其最大激发波长约为 345nm，发射带中心在 634nm 附近，斯托克斯位移达 174nm，大于常用有机染料，避免了激发光源的干扰。并且，配合物 1 的发光强度在 365nm 连续紫外照射 35min 后仍保持稳定，在乙腈中 634nm 处的发光寿命为 878ns，远长于有机染料，这些都表明配合物 1 保留了铱 (III) 配合物良好的光物理性质。
进一步研究发现，加入 Cu+离子后，配合物 1 的发光显著猝灭，200μM 时猝灭效率达 75%，推测是 Cu+结合诱导了配合物 1 的光诱导能量转移（PeT），从而猝灭其3MLCT 发射。随着 Cu+离子浓度增加，配合物 1 发光逐渐减弱并伴有轻微蓝移，在 0.1 - 1μM 和 1 - 10μM 范围内呈线性关系，检测限为 0.05μM。与其他金属离子、氨基酸、谷胱甘肽（GSH）和常见蛋白质牛血清白蛋白（BSA）相比，配合物 1 对 Cu+离子的发光猝灭作用更显著，对 Cu+离子的响应明显强于 Cu2+离子。通过 Benesi - Hildebrand 图和 Job plot 分析，确定配合物 1 与 Cu+离子的结合常数为 7.64×10?2 μM，且以 1:1 的摩尔比形成稳定配合物，这表明配合物 1 不仅能强螯合 Cu+离子，还可用于活细胞发光成像监测。
三阴性乳腺癌细胞中线粒体 Cu+离子的成像
基于溶液中的实验结果，研究人员考察了配合物 1 在人乳腺上皮细胞系 MCF - 10A 和人三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系 MDA - MB - 231 中对 Cu+离子的成像可行性。在 MCF - 10A 细胞中，配合物 1 几乎不发光，而在 MDA - MB - 231 细胞中显示出微弱发光。加入 10μM Cu+离子后，MDA - MB - 231 细胞中配合物 1 的发光显著增强，MCF - 10A 细胞中则仅有轻微增加，这与在溶液中的行为相反，推测是 Cu+负载的探针与细胞蛋白相互作用抑制了 PeT，从而恢复了发光。添加胎牛血清（FBS）后，配合物 1 或 Cu+负载的探针的发光特性得以恢复甚至增强，且对 Cu+负载的探针影响更大，这表明配合物 1 对细胞环境中的 Cu+离子有响应。此外，配合物 1 在有 Cu+离子存在时，能区分 TNBC 细胞和正常乳腺细胞，其在 TNBC 细胞中的发光强度随孵育时间和 Cu+离子浓度增加而增强，具有良好的成像性能。
使用铜离子螯合剂 bathocuproinedisulfonic acid disodium salt（BCDS）进一步验证发现，随着 BCDS 浓度增加，成像发光显著降低，证实了配合物 1 对 MDA - MB - 231 细胞中 Cu+离子的成像能力。通过与商业线粒体染料 MitoTracker Red 共定位实验以及电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）分析，表明配合物 1 能有效靶向线粒体并将 Cu+离子输送到线粒体，在细胞核和细胞质中的含量极少。
配合物 1 在 TNBC 细胞中增强 Cu+离子的抗癌效果
采用 3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基) - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐（MTT）法评估配合物 1 对 MDA - MB - 231 细胞的毒性。在无血清培养条件下，配合物 1 显示出一定的细胞毒性，24h 的半数抑制浓度（IC50）为 6.03μM。加入 Cu+离子后，其细胞毒性增强，IC50降至 1.91μM。添加 1% 血清后，配合物 1 和 Cu+负载的探针 1 的细胞毒性分别增强约 9 倍和 7 倍，IC50值降至 0.68μM 和 0.26μM，表明血清可提供额外的 Cu+离子或促进配合物 1 对 Cu+离子的递送。
测试螯合 N∧N 配体 S2 的细胞毒性发现，其单独存在时无明显细胞毒性，加入 Cu+离子后细胞毒性显著增加，但仍低于配合物 1，这主要归因于铱 (III) 配合物的线粒体靶向性。ICP - MS 实验表明，Cu+负载的探针 1 使线粒体中的铜含量远高于 Cu+负载的化合物 S2 或 Cu+，证实了配合物 1 可促进 Cu+离子转运到线粒体，增强其细胞毒性。使用 BCDS 作为 Cu+离子螯合剂验证发现，BCDS 能有效挽救由 Cu+负载的探针 1 诱导的细胞毒性，进一步证实了配合物 1 诱导的是与 Cu+相关的细胞死亡。
配合物 1 通过铜死亡诱导 TNBC 细胞死亡
目前大多数 Cu 递送策略依赖 Cu2+离子，其进入癌细胞后需经细胞内线粒体铁氧还蛋白 1（FDX1）还原为 Cu+，进而诱导脂酰化蛋白 DLAT 寡聚化，导致细胞死亡。本研究中，配合物 1 直接将 Cu+离子递送至细胞，即使癌细胞中 FDX1 表达较低也能发挥良好的抗癌效果。
DLAT 是丙酮酸脱氢酶复合物的关键成分，对维持三羧酸（TCA）循环的正常功能至关重要。在过量 Cu+离子环境中，Cu+离子与 TCA 循环中脂酸修饰的蛋白质特异性结合，触发这些蛋白质的寡聚化，破坏 TCA 循环的正常代谢活动，诱导细胞内蛋白质毒性应激反应，最终导致细胞死亡，这是铜死亡的典型特征。通过 DLAT 免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹（western blot）实验发现，Cu+负载的探针 1 能与 DLAT 高重叠，且可诱导 DLAT 聚集，同时降低铁硫（Fe - S）簇蛋白脂酰合酶（LIAS）的表达，导致 Fe - S 簇蛋白丧失，增强线粒体蛋白毒性，触发细胞死亡，还会干扰 TCA 循环，影响线粒体功能。此外，铜死亡会导致线粒体功能障碍，引起细胞内活性氧（ROS）代谢异常。实验表明，Cu+负载的探针 1 可显著诱导 ROS 生成，同时降低 GSH 水平，进一步损伤线粒体，导致肿瘤细胞因氧化应激而死亡。
体内生物相容性研究
体内生物安全性是配合物 1 在生物体内应用的关键参数。对昆明小鼠腹腔注射不同剂量（2.5、5 和 10mg kg?1）的 Cu+负载的探针 1，记录 14 天内小鼠体重变化，并对主要器官进行组织病理学分析。结果显示，各处理组小鼠体重变化与对照组相似，主要器官也未出现明显改变或毒性迹象，证实了配合物 1 在体内研究中的生物相容性良好。
与以往的 Cu 离子载体不同，本研究中的铱 (III) 基离子载体能特异性定位于 TNBC 细胞的线粒体，促进线粒体中高浓度 Cu+离子的积累。配合物 1 保留了铱 (III) 配合物的光学特性，对 Cu+离子具有选择性发光响应，且在水性缓冲液和血清中的发光响应相反，能提供更好的成像信噪比。该探针具有高线粒体靶向性，可增强 Cu+离子的细胞毒性，同时在低浓度下就能促进铜死亡生物标志物 DLAT 的变化，还能诱导 ROS 产生和降低 GSH 水平，增强了其化疗功能。
