靶向 BCL-XL的 PROTACs：胶质母细胞瘤治疗的新曙光

本文聚焦胶质母细胞瘤（GBM），合成了两种创新的蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）AN-1 和 AN-2，其能选择性降解 GBM 干细胞（GSCs）中的 BCL-XL，有效抑制 GSC 生长、促进凋亡，且降低血小板毒性，为 GBM 治疗提供新策略。

　　

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性和治疗抗性的原发性脑肿瘤，患者预后差，中位生存期仅 14 个月，2 年生存率低于 10%。目前标准治疗方案包括手术切除、放疗和替莫唑胺化疗，但复发常见，主要原因是 GBM 干细胞（GSCs）的存在，其具有自我更新、分化和形成球体的能力，且对传统放化疗耐药。因此，开发针对 GSCs 的治疗策略至关重要。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡方式，在肿瘤治疗中具有重要意义。BCL-2 蛋白家族在细胞凋亡调控中起关键作用，其中抗凋亡蛋白 BCL-X_L在 GBM 中高表达，与患者预后不良相关，是潜在的治疗靶点。然而，BCL-2/BCL-X_L抑制剂如 ABT-263 虽有抗癌潜力，但因会诱导血小板减少症，限制了其临床应用。

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种新兴的蛋白降解技术，可选择性降解致病靶蛋白，为药物研发开辟新途径。PROTAC 由靶向靶蛋白的配体、靶向 E3 连接酶的配体和连接两者的接头组成，能形成三元复合物，使靶蛋白泛素化并被蛋白酶体降解。选择合适的 E3 连接酶可增强 PROTAC 的特异性和降低毒性。本研究基于 MDM2 在 GBM 中高表达而在血小板中低表达的特点，设计合成了以 MDM2 为 E3 连接酶的靶向 BCL-X_L的 PROTACs（AN-1 和 AN-2），旨在提高治疗特异性并减少血小板毒性。

结果

1. ABT-263 对 GSC 肿瘤发生的调节作用：通过分析 REMBRANDT 和 CGGA 数据库，发现 BCL-X_L mRNA 表达与胶质瘤患者预后不良显著相关，而 BCL-2 的表达与患者预后无关。免疫印迹实验表明，BCL-X_L在 GSCs 中高表达，ABT-263 处理后其表达下调。功能实验显示，ABT-263 抑制 GSCs 的增殖和球体形成能力，诱导细胞凋亡，且呈浓度依赖性。但 ABT-263 对正常星形胶质细胞、GBM 细胞和血小板也有毒性作用，提示需优化药物以减少副作用。
2. AN-1 和 AN-2 诱导 BCL-X_L的蛋白酶体降解：研究发现 MDM2 在 GSCs 中高表达，而 CRBN 和 VHL 在肿瘤细胞中低表达，因此选择 MDM2 作为 E3 连接酶开发靶向 BCL-X_L的 PROTACs。通过将 Nutlin-1 和 ABT-263 的衍生物用不同接头连接，合成了 AN-1 和 AN-2，并通过¹H - 核磁共振（NMR）、¹³C-NMR 和质谱（MS）确认了关键中间体的结构。免疫印迹实验表明，AN-1 和 AN-2 能时间依赖性地降解 BCL-X_L，免疫沉淀实验证实了 BCL-X_L和 MDM2 的相互作用，且 AN-1 和 AN-2 介导的 BCL-X_L降解是 MDM2 依赖的。使用蛋白酶体抑制剂 MG132 和蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理细胞，进一步证明 AN-1 和 AN-2 通过泛素 - 蛋白酶体途径降解 BCL-X_L。此外，AN-1 和 AN-2 处理可上调 P53 表达，减少 MDM2-P53 相互作用，增强肿瘤抑制作用。
3. AN-1 和 AN-2 对 GSCs 的影响：AN-1 和 AN-2 对 GSCs 的增殖具有显著的剂量依赖性抑制作用，且能有效抑制 GSCs 的球体形成能力。免疫印迹和流式细胞术分析表明，AN-1 和 AN-2 可诱导 GSCs 凋亡，且凋亡效果优于 ABT-263，AN-2 的凋亡诱导作用更强。同时，AN-1 和 AN-2 对正常星形胶质细胞、GBM 细胞和血小板的增殖和凋亡相关蛋白表达无明显影响，显示出良好的特异性。
4. AN-1 和 AN-2 在体内的抗肿瘤效果及安全性：在低浓度（0.1 μM）下，AN-1 和 AN-2 诱导 BCL-X_L降解、抑制 GSC 增殖和球体形成的能力均优于 ABT-263。利用 83 GSC 来源的小鼠异种移植模型评估 AN-1 和 AN-2 的体内抗肿瘤潜力，结果显示，AN-1 和 AN-2 能部分穿透血脑屏障（BBB），显著延长小鼠生存期，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。血液学分析表明，AN-1 和 AN-2 的血小板毒性低于 ABT-263，在治疗等效剂量下更安全。

讨论

本研究利用 PROTAC 技术，将高血小板毒性的 ABT-263 转化为 BCL-X_L特异性的 PROTACs（AN-1 和 AN-2），显著降低了副作用。AN-1 和 AN-2 在抑制 GSC 增殖和体内抗 GBM 方面表现出色，且不诱导血小板减少症。与传统抑制技术相比，PROTAC 技术可消除靶蛋白，产生更持久的治疗效果，还可通过选择肿瘤细胞高表达的 E3 连接酶减少对正常细胞的影响。此前研究探索了不同 E3 连接酶的 BCL-X_L靶向 PROTACs，如以 VHL 为 E3 连接酶的 DT2116 和以 CRBN 为 E3 连接酶的 SIAIS361034，均显示出一定的抗肿瘤活性。本研究选择 MDM2 作为 E3 连接酶，有效减轻了血小板毒性，为 GBM 治疗提供了新方向。未来可利用纳米递送策略进一步提高 AN-1 和 AN-2 的循环和肿瘤靶向性，推动其临床转化。

方法

1. 化学合成及结构表征：使用 Bruker AVANCE III 光谱仪记录¹H-NMR 和¹³C-NMR 光谱，以四甲基硅烷（TMS）为内标，CDCl₃和 DMSO-d₆为溶剂。通过薄层色谱（TLC）和柱色谱进行化合物分离和纯化，所用试剂大多为商业来源，无需额外纯化。
2. 细胞培养：GSCs（X01、83 和 448）在添加 B27、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F-12 中培养；星形胶质细胞、U87 和 U251 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 链霉素溶液的 DMEM 中培养。所有细胞在 37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。
3. 细胞增殖实验：将 GSCs 以 1000 个细胞 / 孔的密度接种于 96 孔板，加入药物处理后，使用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测化合物的抗增殖活性，在 450 nm 处测量吸光度，用 GraphPad Prism 7.0 软件进行数据分析。
4. 球体形成实验：将 GSCs 以 800 个细胞 / 孔的密度接种于 24 孔板，培养 12 h 后添加药物，用倒置荧光显微镜观察并量化细胞团形成。
5. 细胞凋亡的流式细胞术分析：将 GSCs 接种于 60-mm 培养板，感染慢病毒后用药物处理，然后用 Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）或 7-AAD 染色，用 BD FACSAria III 流式细胞仪检测，FlowJo v.10 软件处理数据。
6. 免疫印迹：将细胞接种于 6 孔板，药物处理后收集细胞，用 RIPA 缓冲液裂解，BCA 法测定蛋白浓度。通过 10% SDS-PAGE 分离蛋白并转移至 PVDF 膜，用特异性一抗和 HRP 标记的二抗孵育，Tanon-5200 化学发光成像系统检测。
7. 免疫共沉淀（CoIP）：使用 Invitrogen Dynabeads Protein A/G 免疫沉淀试剂盒和相应抗体，对处理后的 GSCs 进行蛋白提取和免疫沉淀，免疫沉淀物和输入蛋白经煮沸后进行免疫印迹分析。
8. 高效液相色谱（HPLC）：给 6 周龄 BALB/c 小鼠注射 AN-1 和 AN-2 后，收集血液和脑组织样本，经处理后用 HPLC 分析 AN-1 和 AN-2 的浓度，采用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 Chiral-V 色谱柱和 UV-vis 检测器，进行梯度洗脱。
9. 体内实验：动物实验遵循河南大学实验室动物中心和伦理委员会批准的方案。将 GSCs 立体定向植入 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠的左纹状体，建立原位小鼠模型。根据小鼠体重随机分组，给予不同处理，观察记录小鼠体重和生存情况，对脑组织进行后续分析，用 GraphPad Prism 软件分析生存数据。
10. 组织学和组织染色：对收获的脑组织进行固定、切片，进行苏木精 - 伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）分析。H&E 染色用于观察组织形态，IHC 分析使用针对 Ki67 和 cleaved caspase-3 的抗体，以 3,3′- 二氨基联苯胺（DAB）为显色剂。
11. 生物信息学分析：从 GlioVis 数据门户获取胶质瘤患者样本中 BCL-X_L和 BCL-2 的表达数据，进行 Kaplan-Meier 生存分析，评估高低表达组患者的生存差异，用 GraphPad Prism 软件生成相关图表。
12. 统计分析：实验重复三次，数据以平均值 ± 标准差（SD）表示。使用 Kaplan-Meier 分析生成生存曲线，方差分析（ANOVA）用于多组数据比较，log rank 检验用于生存比较，两组比较采用两尾 Student’s t 检验，p < 0.05 为具有统计学意义。

资源可用性

如需进一步信息，可联系通讯作者金龙尹（[e-mail]）。本研究使用的所有材料和试剂可向通讯作者索取。支持本研究的所有原始数据和相关图像包含在正文和补充信息中，本文未报告原始代码，如需重新分析数据的额外信息，可向通讯作者索取。

致谢

感谢河南大学药学院的贾伟东博士和上海中医药大学的胡亮教授提供的帮助。本研究由河南省科技研发计划联合基金（232301420017）资助，文中卡通图由Biorender.com制作。

作者贡献

J.Y. 负责监督研究；B.S. 和 Y.Z. 合成化学品；M.L. 和 B.S. 进行实验；R.N. 和 X.L. 协助动物实验；M.L.、B.S.、J.W. 和 J.Y. 撰写论文；X.W. 进行计算研究；J.Y. 设计研究概念。所有作者都对论文有贡献。

利益声明

无利益冲突声明。