揭秘灵长类蓝锥视觉色素早期光反应：希夫碱去质子化与结构动力学的关键作用

为探究灵长类蓝锥视觉色素（MB）早期光反应机制，研究人员通过定点突变、低温 UV - 可见吸收及傅里叶变换红外（FTIR）光谱等技术研究发现，希夫碱去质子化与 α - 螺旋局部扰动相关，Glu113 是质子受体，该成果有助于理解视觉色素激活及进化。

　　在动物的视觉系统中，视觉色素起着至关重要的作用。动物视紫红质是一种光感受蛋白，它的激活源于视网膜发色团在吸收光后发生的顺反异构化，随后引发一系列热中间体的产生，最终通过 G 蛋白介导信号转导，让动物能够感知光线并产生视觉。其中，视网膜发色团通过质子化的希夫碱与蛋白质共价结合，在活性中间体形成过程中，希夫碱的去质子化被认为会诱导 α - 螺旋结构发生变化，进而促进与 G 蛋白的相互作用。

然而，目前关于视觉色素早期光反应的机制仍存在诸多未解之谜。比如在早期光反应过程中，希夫碱去质子化的具体过程、质子受体的身份、促进质子转移的结构基础，以及为何某些视觉色素在早期光反应中会出现独特的质子转移反应等问题，都有待深入研究。为了揭开这些谜团，名古屋工业大学（Nagoya Institute of Technology）和京都大学（Kyoto University）的研究人员 Yosuke Mizuno、Kota Katayama、Hiroo Imai 和 Hideki Kandori 开展了关于灵长类蓝锥视觉色素（MB）早期光反应的研究，相关成果发表在《Biophysical Journal》上。

研究人员为了深入了解 MB 早期光反应机制，采用了多种关键技术方法。在样本处理方面，将编码灵长类蓝色素的 cDNA 进行处理并在昆虫细胞中表达，随后经过一系列复杂的步骤进行样本的纯化和再生。在检测分析时，运用低温 UV - 可见吸收光谱和傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术，来观测 MB 在光反应过程中的变化。同时，利用定点突变技术，构建各种突变体，以此探究不同氨基酸残基在光反应中的作用。

研究结果主要分为以下几个方面：

1. 确定质子受体：通过对潜在质子受体 Glu113 和 Glu181 进行定点突变，研究 UV - 可见吸收光谱变化。结果发现 E113D 突变体出现 7nm 红移，而 E181D 突变体无可见吸收，且 E113D 突变体在光照下不发生希夫碱去质子化，有力证明 Glu113 是希夫碱的质子受体123。
2. 探究蛋白结构变化：分析 WT 和 E113D 突变体的 FTIR 光谱，发现 E113D 突变体在 223K 时不发生质子转移，BL 中间体积累。研究还发现，在 Lumi 中间体形成过程中，TM3 局部结构恢复，而 TM7 发生局部运动，使希夫碱与 Glu113 距离缩短，促进质子转移。这一结论是通过对 Thr118 和多个半胱氨酸残基进行突变，分析 FTIR 光谱变化得出的456。
3. 发现热重异构化与质子回传反应：研究观察到 Lumi 中间体在低温下不稳定，会逐渐恢复到初始状态。通过温度依赖的测量计算出恢复反应的活化能，发现该过程伴有希夫碱的重新质子化和视网膜从全反式到 11 - 顺式的异构化789。

在讨论部分，研究人员指出，他们首次明确了 Glu113 作为 MB 中希夫碱去质子化的质子受体，且 Lumi 中间体不稳定，会逆向转变回初始状态，其活化能低于牛视紫红质中视网膜热异构化的活化能，从热力学角度支持了研究结果。此外，MB 和人类蓝色锥色素（HB）同属灵长类且序列相似，但之前研究显示 HB 的 Lumi 中间体在室温下希夫碱似乎保持质子化，与该研究中 MB 的情况不同。不过考虑到低温下去质子化的 Lumi 中间体不稳定且与 BL 中间体存在平衡，这种差异是可以理解的。而且，MB 和 HB 属于对紫紫外光敏感的 S 或 SWS1 锥色素，其初始状态因希夫碱质子化而吸收可见光，但 MB 的希夫碱 pKa 值低于视紫红质以及红色和绿色色素，这表明 MB 更易发生去质子化，符合其所属色素家族的特征。在结构变化方面，研究表明 TM7 的局部运动是 MB 中希夫碱去质子化的关键结构因素，这与其他视觉色素不同，体现了 MB 在 Lumi 中间体形成过程中结构变化的独特性。

综上所述，该研究首次揭示了灵长类蓝锥视觉色素（MB）在 Lumi 中间体形成过程中，希夫碱向 Glu113 的质子转移以及 TM7 的局部扰动现象，这些特征在其他动物视紫红质中尚未见报道，可能与动物视紫红质的分子进化密切相关。该研究为深入理解光转导的分子机制提供了重要依据，有助于进一步探究视觉色素的激活机制，对其他 G 蛋白偶联受体（GPCR）的研究以及 GPCR 靶向药物的开发也具有重要的参考价值。