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为探究 VvLRK10L 基因与植物发育关系，研究人员克隆 4 个 VvLRK10L 基因并分析相关特性。结果发现 VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 定位于质膜，能响应激素信号、促进拟南芥发育。该研究为解析植物发育机制提供理论依据。
在植物的奇妙世界里，生长与发育过程受诸多因素精细调控，而受体样激酶（RLK）便是其中的重要角色。RLK 作为一种膜蛋白，像植物细胞的 “信号侦察兵”，其胞外配体结合域能精准识别并结合病原体、肽或激素等各种胞外信号，然后将这些信号传递到细胞内，进而调控植物的生长发育进程。根据序列特征，RLK 可分为不同类型，广泛参与植物生长、胁迫响应和细胞内信号转导等过程。
LRK10 激酶作为 RLK 的一个亚家族，一直以来备受关注。在小麦中，首个被鉴定的 RLK 基因就位于 Lr10 抗性位点，与叶锈病病原体的抗性位点共分离，因此得名 LRK10。以往对 LRK10 的研究大多集中在其对胁迫响应的调节机制上，例如在拟南芥中，PR5K（LRK10）参与植物对疾病的免疫调节 。然而，对于 LRK10 在植物果实成熟过程中的作用，人们知之甚少。
葡萄，这种在全球广泛种植且兼具高经济和营养价值的水果，其果实成熟机制的研究意义重大。“巨峰” 葡萄是生产中的主要品种之一，而 “丰早” 作为 “巨峰” 的早期芽变品种，成熟时间比 “巨峰” 早 20 天，为研究发育调控基因提供了理想材料。研究人员在前期从葡萄基因组中鉴定出 109 个 VvLRK10L 基因，并发现其中 4 个基因在果实发育过程中表达上调，且在 “丰早” 中的表达显著高于 “巨峰”，推测它们可能是调控果实成熟的候选基因。为了深入探究 VvLRK10L 基因的功能，来自河南科技大学的研究人员开展了一系列研究。
研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因克隆技术，从 “巨峰” 葡萄中成功克隆出 VvLRK10L-16、VvLRK10L-40、VvLRK10L-41 和 VvLRK10L-42 基因的编码序列（CDS）。接着，通过生物信息学分析工具，如 SMART 网站和 ExPASy 数据库，对基因序列和编码蛋白的理化性质进行分析。利用 MEGA7.0 软件构建系统发育树，探究 VvLRK10L 基因与其他物种相关基因的进化关系。在亚细胞定位研究中，将目标基因插入特定载体后转化到烟草叶片，借助激光共聚焦扫描显微镜观察其定位。通过克隆基因启动子序列，转化烟草叶片并进行 GUS 染色分析启动子活性。最后，构建植物表达载体并转化拟南芥，观察转基因植株的生长发育表型。
研究结果
- 基因克隆与序列分析：研究人员成功获取了 VvLRK10L-16、VvLRK10L-40、VvLRK10L-41 和 VvLRK10L-42 基因的 CDS 序列。分析发现，这些基因都含有高度保守的 Pkinase_Tyr 结构域，部分基因还具有其他独特结构域。此外，部分基因编码的是稳定蛋白，部分则不稳定，除 VvLRK10L-41 外，其他三个基因都有跨膜结构。
- 系统发育分析：通过对四个 VvLRK10L 基因氨基酸序列的 BLAST 比对，以及与其他物种高同源序列构建系统发育树，发现 VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-41 与榴莲的锈病抗性激酶 Lr10-like 亲缘关系更近，VvLRK10L-40 则与澳洲坚果的相关基因聚类，同一聚类中的基因可能具有相似功能。
- 启动子序列克隆与顺式作用元件分析：从四个基因中总共鉴定出 25 个顺式作用元件，其中光响应相关元件最为丰富，同时每个基因还包含与激素响应、胁迫响应和生长相关的元件。不同基因中的激素响应元件有所差异，表明它们可能通过不同调控途径参与果实发育。
- VvLRK10L 基因的亚细胞定位：经 Plant-PLoc 分析预测，并通过农杆菌介导法将重组质粒转化烟草叶片，利用激光共聚焦扫描显微镜检测发现，VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 仅在质膜上有绿色荧光，证实它们定位于质膜。
- 启动子活性分析：克隆含有激素相关元件的 VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 基因启动子序列，转化烟草叶片后进行 GUS 染色分析。结果显示，这两个基因能启动 GUS 蛋白表达，且 GA3和 ABA 处理分别增强了它们的启动子活性，表明其在植物发育中的功能由 GA3和 ABA 介导。
- VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 过表达促进拟南芥生长：在拟南芥中过表达 VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 基因，与野生型（WT）相比，转基因植株在幼苗期根的数量显著增加，VvLRK10L-42 过表达还使莲座叶数量增多，说明这两个基因具有促进生长的作用。
- 转基因植株早熟：观察拟南芥成熟阶段的表型发现，VvLRK10L-16 转基因植株的豆荚在 70 天就完全成熟，而 WT 植株尚未成熟；VvLRK10L-42 转基因植株的豆荚在 73 天成熟开裂，WT 植株的豆荚才开始变黄，且转基因植株的豆荚比对照更长，表明 VvLRK10L 基因能促进植物成熟。
研究结论与讨论
该研究成功克隆了 VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 基因及其启动子序列，对启动子顺式作用元件进行分析，并开展了启动子活性分析和亚细胞定位实验。在拟南芥中过表达这两个基因，发现它们能促进豆荚早熟。研究表明，VvLRK10L-16 和 VvLRK10L-42 定位于质膜，含有与发育相关的顺式作用元件，启动子具有活性。这些结果为进一步研究 VvLRK10L 基因在果实发育中的功能提供了重要的理论依据。
尽管目前已经明确 VvLRK10L 基因具有促进植物生长和成熟的作用，但它们促进果实成熟的分子机制仍有待进一步深入研究。未来的研究可以围绕 VvLRK10L 基因在激素信号通路中的具体作用机制展开，探究它们如何与其他蛋白相互作用，从而精细调控植物的生长发育进程。这不仅有助于人们深入理解植物果实成熟的奥秘，也为农业生产中调控果实成熟时间、提高果实品质提供了潜在的理论支持和技术手段 。该研究成果发表在《Electronic Journal of Biotechnology》上，为植物发育生物学领域的研究增添了新的重要内容。
