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这篇研究聚焦慢病毒载体（LVs）在基因治疗中的应用。因 LVs 存在潜在风险，准确测量其载体拷贝数（VCN）和整合位点至关重要。研究人员开发 NIST 候选参考材料（RMs），经多实验室评估，证明其可提升 VCN 等测量的准确性和可靠性，为基因治疗质量控制提供关键支持。
慢病毒载体在基因治疗中的应用与风险
慢病毒载体（LVs）能转导多种细胞并整合基因，在基因和细胞治疗中应用广泛，如用于治疗免疫缺陷、肾上腺脑白质营养不良等疾病，全球有众多相关临床试验。然而，LVs 存在潜在风险，如插入基因失活、诱变和致癌性等。其整合位点有偏好且不受控制，高整合数会增加不良影响风险。监管机构要求报告 VCN 并进行长期随访，目前 FDA 正在调查 CAR - T 细胞治疗后出现的二次 T 细胞癌病例，凸显测量 LVs 相关参数的重要性。
测量方法的挑战与参考材料的需求
当前测量 LVs 整合拷贝数的方法，如定量 PCR（qPCR）、数字 PCR（dPCR）和下一代测序（NGS）存在局限性。qPCR 因实验复杂性和缺乏标准，结果常不一致；NGS 虽可测整合位点，但缺乏标准化方法和生物信息学流程，分析存在困难。世界卫生组织（WHO）和其他机构开发的参考材料（RMs）在应用中也面临挑战，如部分整合位点难以达成共识，因此需要更优质的 RMs。
NIST 候选 RMs 的开发与特性
研究人员开发了一组 NIST 候选 RMs，包括人类基因组 DNA 样本和固定细胞，其 VCN 明确。对这些候选 RMs 进行了生产总结、G - 带核型分析、VCN 测定和稳定性评估、同质性评估。结果显示，材料制备规范，除 VCN2 克隆外，其他克隆基因组稳定；DNA 候选 RMs 在至少 810 天内稳定；VCN 候选 RMs 具有良好的同质性。
多实验室研究评估
12 个实验室参与了这项跨实验室研究，使用 qPCR、dPCR 和 NGS 等方法对 LVs 整合拷贝数进行定量分析，部分实验室还使用了成像方法评估整合位点。qPCR 测量时，多数实验的 qPCR 效率在可接受范围，但因校准物和参考基因选择不同，结果存在差异。dPCR 能直接测量核酸浓度，无需校准，各实验室间 VCN 测量差异较小。通过 NIST Consensus Builder 计算 dPCR 结果的共识值，得到了各样本的 VCN 和 LV 拷贝浓度共识估计值。
整合位点分析
三个实验室用 NGS - 基于的方法评估候选材料的 LV 整合位点，最初结果存在差异，经重新分析和优化生物信息学流程，大部分差异得到解决。研究发现部分整合位点与之前报道不同，通过多种测序方法确认了新的整合位点。此外，分子梳技术也用于识别整合位点，验证了候选 RMs 对评估新技术的效用。
讨论
qPCR 测量 VCN 需使用可互换标准和验证的实验方法，dPCR 虽有优势，但也存在分区体积不确定性等问题。研究整合位点和 VCN 对评估 LVs 安全性至关重要，目前整合位点检测面临挑战，需要标准化方法。LVs 整合有偏好性，多位于基因内区域。分子梳技术可用于确认整合位点，但存在局限性。NIST VCN 候选 RMs 有助于统一测量结果，但使用 NGS 方法分析复杂样本时仍需谨慎。未来计划开发更适用的参考材料。
材料和方法
研究使用的 Jurkat 细胞系虽建立于当前研究使用同意流程之前，但经相关委员会评估，其基因组数据公开风险较小。研究涉及细胞系培养、基因组 DNA 提取、固定细胞和细胞栓制备、同质性和稳定性分析、跨实验室研究、多种测序和分析方法等，各步骤均有详细的操作流程和技术支持。
本研究开发的 NIST 候选 RMs 经多实验室评估，证明在多种测量方法中具有实用性和适用性，为慢病毒载体相关测量提供了重要参考，有助于推动基因治疗领域的发展，但也指出了当前研究的不足和未来方向。
