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本文研究了 mRNA 脂质纳米颗粒（LNPs）疫苗经鼻内给药后的效果。通过对比不同 LNP 配方，发现其在肌肉注射和鼻内给药时，货物递送和免疫原性存在差异。鼻内给药虽能有效转染肺部细胞，但免疫原性有限，不过可召回免疫反应，为疫苗研发提供了新思路。
研究背景
新冠疫情凸显了有效疫苗的重要性，肌肉注射（i.m.）mRNA 新冠疫苗虽能诱导强大的全身免疫，预防重症，但在病毒进入部位诱导黏膜免疫反应的能力有限。鼻内（i.n.）接种有望诱导黏膜抗体（IgA 和 IgG）以及组织驻留记忆 T 和 B（BRM）细胞，从而预防感染、控制病毒复制和减少传播 。然而，目前开发鼻内新冠疫苗的尝试临床效果有限，mRNA - 脂质纳米颗粒（LNPs）是潜在的鼻内疫苗递送平台，但其效用和安全性尚未完全确立。现有 LNP 配方通常包含四种成分，其中可电离脂质在 mRNA 递送和免疫反应中起关键作用，但目前许可的 mRNA - LNP 疫苗经鼻内给药在非人灵长类动物模型中诱导的免疫反应微弱 。使用带正电的材料（如 DOTAP）似乎可改善黏膜递送，但 mRNA 疫苗经鼻内给药诱导局部免疫的机制尚不清楚。
研究目的
本研究旨在解析 mRNA 货物递送过程以及在呼吸道黏膜和相关淋巴部位的免疫反应生成机制。对比使用临床批准的可电离脂质（ALC - 0315、SM - 102 和 MC3）单独或添加阳离子脂质 DOTAP 制备的 mRNA - LNPs 的免疫原性。
研究方法
- 制备 mRNA - LNPs：采用微流控混合方法，使用 NanoAssemblr Ignite 系统制备 mRNA - LNPs。将特定分子比例的脂质（包括可电离脂质、阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和 PEG - 脂质）溶解在乙醇中，mRNA 溶解在醋酸盐缓冲液中，两者混合后透析纯化，过滤后储存于 - 80°C 。
- 表征 mRNA - LNPs：运用动态光散射（DLS）测量纳米颗粒的动态直径和 zeta 电位；通过冷冻电子显微镜（cryo - EM）观察形态；利用 Quant - iT RiboGreen RNA 检测试剂盒测定包封效率。
- 病毒拯救与增殖：运用八质粒反向遗传学方法拯救重组 PR8 流感病毒，将编码 OVA 免疫原的基因克隆到 NS 修饰的 pHW200 载体中，转染 293T 细胞后与 MDCK 细胞共培养，进行病毒的纯化和增殖 。
- 免疫荧光测定：用野生型 PR8 或 OVA PR8 感染 A549 细胞，固定、透化后用相应抗体染色，在荧光显微镜下观察 OVA 和流感 HA 蛋白的表达。
- 小鼠免疫与感染：选用 6 - 12 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠，分别进行肌肉注射、鼻内接种和鼻内感染实验。肌肉注射给予 5μg OVA 蛋白加佐剂或 5μg mRNA 的 OVA mRNA - LNPs；鼻内接种给予 2μg OVA 蛋白或 2μg mRNA 的 OVA mRNA - LNPs；鼻内感染给予野生型 PR8（100 pfu）或 OVA PR8（105.5 pfu） 。
- 样本收集：在每次接种后第 14 天收集血清、支气管肺泡灌洗液（BALF）和鼻洗液。
- ELISA 检测：采用直接 ELISA 法检测血清、BALF 和鼻洗液中抗原特异性 IgG 滴度。
- 流式细胞术检测：运用流式细胞术分别检测 OVA 特异性 B 细胞和 tdTom 在肺部免疫细胞亚型中的表达。
- 共聚焦显微镜观察：对 Ai14 小鼠进行肌肉或鼻内给药后，取相应组织固定、脱水、包埋、切片，染色后用共聚焦显微镜观察。
- 统计分析：数据以中位数或中位数 ± 四分位距（IQR）表示，使用 GraphPad Prism 10 进行统计分析，两组比较采用非参数 Mann - Whitney 检验，多组比较采用 Kruskal - Wallis 检验和事后 Dunn 多重比较检验，p < 0.05 为差异有统计学意义。
研究结果
- LNP 配方对 i.m. 接种后体液免疫反应的影响
- 制备的 mRNA - LNPs 中，添加 DOTAP 会使颗粒尺寸增大，表面电荷由负变正。
- 肌肉接种后，原型 mRNA - LNP 疫苗（ALC - 0315 和 SM - 102）在血清和 BALF 中诱导出强大的 OVA 特异性 IgG 反应，而添加 DOTAP 的配方（如 SM102 - DOTAP 和 MC3 - DOTAP）免疫原性较差。
- 对引流淋巴结（dLNs）中 GC B 细胞和记忆 B 细胞的分析表明，ALC - 0315 和 SM - 102 疫苗接种后，这些细胞的数量明显高于其他疫苗组。
- 通过 Ai14 小鼠模型研究发现，ALC - 0315 LNPs 能有效在体内递送 mRNA 货物，而 MC3 - DOTAP LNPs 转染效率较低，这可能是其免疫原性有限的原因。
- mRNA - LNP 经 i.n. 免疫后的高效递送与有限免疫原性
- 利用 Ai14 小鼠模型评估发现，MC3 - DOTAP 和 ALC - 0315 mRNA - LNPs 经鼻内给药后，都能将 CRE mRNA 有效递送至肺细胞，但 ALC - 0315 的转染效率更高。MC3 - DOTAP LNPs 选择性转染上上皮细胞，而 ALC - 0315 LNPs 转染的 tdTom+细胞中大部分为 CD45+免疫细胞 。
- 在免疫原性方面，鼻内接种后，MC3 - DOTAP 疫苗在 BALF 和鼻洗液中诱导的 IgG 水平略有增加，但所有疫苗在血清中均未检测到 OVA 特异性 IgG。在纵隔淋巴结中，各疫苗诱导的 OVA 特异性 GC B 细胞和记忆 B 细胞数量均较少 。
- mRNA - LNP i.n. 接种未能在炎症呼吸道组织中召回预先建立的 B 细胞
- 用野生型 A/Puerto Rico/08/1934 流感（WT PR8）或表达 OVA 蛋白的 PR8 病毒（OVA PR8）感染小鼠，建立炎症肺模型。感染后第 21 天，鼻内接种 MC3 - DOTAP、ALC - 0315 mRNA - LNPs 或 PBS 对照 。
- 结果显示，接种 mRNA - LNP 后，仅在感染 OVA PR8 的小鼠中观察到黏膜 IgG 水平略有增加。尽管肺中存在诱导性支气管相关淋巴组织（iBALT），但 mRNA - LNPs 接种后在肺中诱导的原发性免疫原性有限，未观察到 BRM 细胞的显著增加 。不过，在肺引流的纵隔淋巴结（mLNs）中，感染 OVA PR8 的小鼠接种 mRNA - LNP 后，抗原特异性 GC 和记忆 B 细胞数量明显增加，表明 mRNA - LNP 鼻内接种可能在召回局部次级淋巴组织中预先建立的免疫方面发挥作用。
- 鼻内加强免疫可在预先免疫的情况下召回全身和黏膜反应
- 对先前经肌肉接种 OVA 蛋白或 ALC - 0315 mRNA - LNP 的小鼠，在第 21 天进行鼻内加强免疫，给予 MC3 - DOTAP、ALC - 0315 OVA mRNA - LNP 或 PBS 对照 。
- 加强免疫 14 天后，发现用 MC3 - DOTAP 加强免疫的小鼠血清和 BALF 中 OVA 特异性 IgG 滴度增加，鼻内 IgG 也有轻微增加。在肺引流的 mLNs 中，MC3 - DOTAP 加强免疫后，OVA 特异性 GC B 细胞和记忆 B 细胞数量显著增加，表明鼻内递送 OVA 抗原足以在肺引流的次级淋巴部位召回全身免疫。
研究讨论
- mRNA - LNP 疫苗鼻内给药的现状与问题：在新冠疫情期间，肌肉注射 mRNA - LNP 疫苗效果显著，但鼻内给药的应用尚未确立。动物模型中，鼻内给予标准 mRNA - LNP 配方疫苗效果不佳，且存在炎症风险，本研究也发现 ALC - 0315 或 SM - 102 mRNA - LNPs 经鼻内给药时，虽能在呼吸道黏膜免疫细胞中有效转染 mRNA，但无法在肺部或肺引流淋巴结中引发免疫反应 。
- 阳离子脂质 DOTAP 的作用与局限：将阳离子脂质 DOTAP 掺入 LNP 配方（MC3 - DOTAP）可使 mRNA 有效递送至肺部，但在肌肉或 dLN 中转染效率有限，且无明显免疫原性。鼻内给药时，MC3 - DOTAP mRNA - LNPs 虽能转染上皮和免疫细胞，但仍无法增强免疫，说明仅在呼吸道表达疫苗抗原不足以驱动黏膜免疫反应的生成 。
- 鼻内接种病毒载体疫苗与 mRNA - LNP 疫苗的差异：鼻内接种病毒载体疫苗通常能在临床前动物模型中诱导高水平的全身和黏膜抗体以及组织驻留 B 和 T 细胞反应，但本研究中，通过流感感染建立的预炎症肺模型未能挽救鼻内递送 mRNA 疫苗诱导的组织局部 B 细胞反应 。
- “prime & pull” 策略的可行性：鉴于人类对多种呼吸道病原体具有预先免疫力，本研究测试了 “prime & pull” 策略，即通过鼻内加强免疫来扩大呼吸道黏膜的免疫反应。结果表明，鼻内加强免疫可增加全身和黏膜部位的抗原特异性抗体滴度，MC3 配方中添加阳离子脂质 DOTAP 似乎增强了回忆反应，但具体机制有待进一步研究 。
- 研究的意义与展望：本研究表明，当前 mRNA - LNP 配方在呼吸道黏膜直接免疫方面效用有限，但作为鼻内加强剂具有潜力，添加 DOTAP 可能增加其引发回忆反应的能力。此外，mRNA 货物向黏膜的有效递送也为非疫苗应用（如递送 mRNA 疗法或抗病毒单克隆抗体疗法）提供了可能。未来需要进一步优化 mRNA - LNP 配方，以平衡 mRNA 递送、免疫原性和黏膜给药部位的安全性。
