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本文聚焦鼻咽癌（NPC）与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）感染的关联。研究通过分析 EBV 基因组突变预测表位，构建多表位 mRNA 疫苗。发现疫苗联合自然杀伤细胞（NK）可协同抑制或根除人源化小鼠的 NPC 肿瘤，为治疗 EBV+NPC 提供了新策略。
引言
鼻咽癌（NPC）是鼻咽部的主要恶性肿瘤，其发病具有显著的地域差异。在世界大部分地区发病率较低，但在北非和东南亚等地呈地方性流行。传统治疗方法对局部区域疾病患者有效，但未分化的 NPC 具有高侵袭性和转移性，易导致初始治疗失败。目前，免疫疗法如免疫检查点抑制剂（ICIs）和过继细胞疗法（ACT）正处于积极研究阶段，为改善晚期 NPC 患者的治疗效果提供了新途径。
大多数未分化的 NPC 与爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）感染存在病因学关联。EBV 可在癌前病变中检测到，对 NPC 的发生发展至关重要，因此成为 NPC 靶向治疗的有吸引力的候选靶点。治疗性疫苗通过激发个体对病毒抗原的 T 细胞免疫，进而对抗 EBV 感染的癌细胞，已成为一种潜在的治疗选择。然而，早期临床试验表明，虽然治疗性 EBV 疫苗具有安全性和免疫原性，但仅部分患者表现出强烈的 T 细胞反应。
肿瘤疫苗的有效性受到肿瘤异质性、主要组织相容性复合体 I 类（MHC class I）下调和免疫抑制性肿瘤微环境（TMEs）的限制。目前，癌症疫苗常需与其他疗法联合使用，以克服免疫逃逸，提高治疗效果。自然杀伤细胞（NK）是一种专门针对新生异常转化细胞和病毒感染细胞的效应细胞群体，其介导的细胞毒性不依赖于人类白细胞抗原（HLA），可消除因 HLA 缺失而逃避免疫监视的癌细胞，如 EBV+NPC 细胞。研究表明，TME 中较高的 NK 细胞比例与 EBV+NPC 患者的预后改善相关。因此，肿瘤疫苗联合同种异体 NK 细胞有望通过激活肿瘤特异性适应性免疫和 MHC 非限制性细胞毒性发挥双重抗肿瘤作用，但二者联合治疗 EBV+NPC 的潜在协同效应尚未得到探索。
结果
- 预测具有广泛 HLA 覆盖的 EBV 表位：研究人员分析了 283 种与癌症相关的 EBV 菌株的基因组变异，以非癌起源的 B95 - 8 EBV 菌株为参考，预测由这些突变编码的免疫原性表位。结果发现 EBV 致癌基因中存在高频非同义单核苷酸变异（nsSNVs）和插入缺失（indels），并进一步预测出具有广泛 HLA 覆盖的免疫原性 EBV 表位。最终选择了 6 个预测具有广泛人群覆盖的表位用于后续的 mRNA 疫苗构建。
- mRNA 疫苗诱导抗原特异性 T 细胞反应：合成的多表位 EBV mRNA 疫苗（nEL 疫苗）在人源化小鼠 EBV+NPC 模型中进行测试。结果显示，接种 nEL 疫苗的小鼠在第 24 天和第 27 天肿瘤生长受到显著抑制，肿瘤组织重量明显减轻。此外，接种疫苗的小鼠对所有预测表位均产生了 T 细胞反应，且肿瘤病变中人类 CD4+和 CD8+T 细胞的浸润明显增加。然而，该疫苗在控制肿瘤生长方面的效果有限。
- 优化系统生产高质量人类 NK 细胞：为确保与 mRNA 疫苗联合治疗中合格人类 NK 细胞的持续生产，研究人员优化了 NK 细胞扩增方案。通过流式细胞术分析发现，优化后扩增的 NK 细胞中，超过 90% 的细胞表达 NK 细胞激活受体 NKG2D 和 NKp30，且大部分细胞（超过 90%）可表达颗粒酶 B 和穿孔素，表明其具有细胞毒性表型。该优化方法可稳定生产具有高活力和高纯度的细胞毒性 NK 细胞。
- 联合治疗促进 EBV+NPC 根除：在评估联合治疗的安全性后，研究人员在人源化小鼠 EBV+NPC 模型中评估了 nEL 疫苗与同种异体 NK 细胞联合治疗的效果。结果显示，联合治疗和单独 NK 细胞治疗均显著抑制了肿瘤生长，且联合治疗表现出更强的抗肿瘤效果，能够有效根除人源化小鼠中已建立的 NPC 肿瘤，50% 的联合治疗小鼠肿瘤完全消退。此外，联合治疗在不同遗传背景的人源化小鼠中均表现出良好的疗效，且安全性良好。
- 联合治疗引发的免疫反应特征：联合治疗的小鼠血清中人类肿瘤坏死因子 α（hTNF - α）和干扰素 γ（hIFN - γ）水平较高，表明联合治疗可协同诱导增强的抗肿瘤反应。通过细胞内细胞因子染色（ICS）和荧光激活细胞分选（FACS）分析发现，mRNA 疫苗的 6 种 EBV 抗原中，3 种诱导了 CD8+T 细胞反应，另外 3 种诱导了 CD8+和 CD4+T 细胞反应，表明诱导了平衡的适应性免疫反应。免疫组化（IHC）染色显示，联合治疗的肿瘤中效应细胞因子人类颗粒酶 B 和 IFN - γ 水平显著升高，且人类 NK 细胞和 T 细胞的浸润明显增加。
讨论
人源化小鼠模型在免疫肿瘤学研究中具有重要价值。在本研究中，使用 PBMC 人源化小鼠评估 mRNA 疫苗和联合治疗的有效性。虽然 PBMC 人源化 NOG 小鼠在引发抗原特异性体液反应方面能力有限，但能够恢复人类细胞免疫，有助于研究人类对癌症疫苗和过继细胞疗法的免疫反应。不过，该模型存在 GvHD 快速发展的局限性，本研究通过预筛选供体 PBMCs，尽量减少了 GvHD 对实验结果的影响。
从癌症相关 EBV 菌株中直接搜索表位是一种创新策略。研究人员通过分析病毒基因组中的非同义突变，预测出具有强 HLA 结合亲和力和广泛 HLA 覆盖的常见表位，并构建了 mRNA 疫苗。在疫苗免疫原性测定中，在不同 HLA 类型的人源化小鼠中检测到了针对每个表位的 T 细胞反应，但这些表位是否能被广泛的 HLA 等位基因呈递，还需进一步实验验证。
单独使用 mRNA 疫苗治疗效果不佳，可能是由于 mRNA 稳定性和翻译能力、疫苗接种时间和剂量、接种途径等因素影响，也可能与 PBMC 人源化小鼠中抗原呈递细胞（APCs）数量有限以及免疫抑制性 TME 有关。联合治疗策略具有重要意义，NK 细胞因其强大的抗肿瘤活性和良好的安全性，成为有吸引力的联合治疗选择。本研究中使用同种异体 NK 细胞，是因为其具有 “现成可用”、基线细胞毒性强、对 TME 驱动的抑制具有内在抗性等优势。
联合治疗比单一疗法具有更强的肿瘤控制或根除能力。其协同效应的机制可能包括 NK 细胞对 HLA 低表达或不表达的 NPC 细胞的识别和清除，以及 NK 细胞与抗肿瘤 T 细胞之间的复杂相互作用，如 NK 细胞通过 CD27 - CD70 相互作用促进保护性抗肿瘤 T 细胞免疫的发展，提供早期 IFN - γ 促进 Th1 细胞极化，进而促进 CD8+细胞毒性 T 细胞的增殖、激活和浸润。
材料和方法
- EBV 表位预测：收集 EBV 基因组测序数据，将序列读段映射到 EBV 参考基因组，调用基因组变异。对变异肽进行不同类 HLA 等位基因的结合亲和力预测，并计算群体覆盖率，最终选择 6 个表位用于 mRNA 疫苗构建。
- mRNA 疫苗构建和给药：基于先前报道的 DNA 骨架开发质粒模板，将编码表位的序列或 EGFP 亚克隆到质粒中，线性化后进行体外转录、纯化和加帽。将 nEL mRNA 与脂质体混合制备疫苗，每 3 - 4 天接种一次，共接种 3 次。
- 细胞系和细胞培养：购买 K562 和 HEK - 293T 细胞系，由香港大学的关新元教授提供 EBV+人 NPC 细胞系 CNE2 - EBV。所有细胞系经鉴定和支原体污染检测后，在含 10% FBS、青霉素和链霉素的 RPMI 1640 培养基中培养。
- 人源化小鼠模型：购买 NOD.Cg - PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicCrl（NOG）小鼠，在特定病原体 - free（SPF）环境下进行动物实验。通过 Ficoll - Hypaque 密度梯度离心纯化人 PBMCs，选择低同种异体反应性的供体 PBMCs 静脉注射到小鼠体内，建立人源化小鼠模型。随后，将 CNE2 - EBV 细胞皮下注射到小鼠右侧胁腹，建立人源化小鼠 EBV+NPC 模型。
- 体外 NK 细胞扩增和同种异体 NK 细胞输注：从健康供体的 PBMCs 中扩增 NK 细胞，使用优化的扩增方案，包括预包被培养瓶、添加特定细胞因子等。扩增后的 NK 细胞经计数和重悬后，静脉注射到小鼠体内，共注射 3 次。
- 流式细胞术：使用特定抗体对 NK 细胞进行表面染色和细胞内细胞因子染色，通过流式细胞仪分析 NK 细胞的表型和功能，以及抗原特异性 CD4+或 CD8+T 细胞反应。
- NK 细胞细胞毒性分析：将 NK 细胞与靶细胞（K562 或 CNE2 - EBV）按不同效应细胞 / 靶细胞比例共培养，通过 LDH 细胞毒性检测试剂盒分析培养上清，计算 NK 细胞的特异性杀伤率。
- ELISA：使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测小鼠外周血中的人 IFN - γ 和 TNF - α 水平。
- 人 IFN - γ ELISpot 测定：使用细胞因子特异性酶联免疫斑点（ELISpot）试剂盒分析接种疫苗或对照小鼠的脾细胞中产生 hIFN - γ 的细胞。
- 免疫染色和组织学：对肿瘤和组织进行固定、脱水、石蜡包埋和切片。进行 H&E 染色和免疫染色，使用特定抗体检测相关蛋白的表达，通过显微镜观察并拍照。
- 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析，根据不同实验数据选择合适的统计方法，如普通双向 ANOVA、非配对双尾 t 检验、普通单向 ANOVA 等，以确定数据的统计学意义。
本研究表明，EBV mRNA 疫苗与过继性 NK 细胞联合治疗是一种治疗 EBV+NPC 的潜在策略，但仍需进一步研究其协同机制和长期益处。
