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在药物研发中，内源性生物标志物定量困难易致研究结果偏差。研究人员开发并验证用替代基质定量新蝶呤（neopterin）作为药效学生物标志物（PD Biomarker）的方法。结果显示该方法可靠，为 FDA 临床研究提供支持。
在药物研发的漫漫长路上，生物标志物就像是关键的 “指示灯”，能帮助科研人员判断药物的效果，以及人体的生理和病理状态。然而，内源性生物标志物的检测与定量却困难重重。它们在生物体内的浓度常常很低，而且还会受到昼夜节律、年龄、性别、饮食、遗传和疾病状态等多种因素的影响而上下波动。要是在生物分析方法的开发和验证过程中，没有妥善处理这些因素，那研究结果很可能就会出现偏差，给后续的药物研发工作带来误导。
新蝶呤（neopterin）作为一种特征明确的生物标志物，在评估细胞介导的免疫反应强度方面有着重要作用。无论是面对感染性疾病（像病毒、细菌、寄生虫感染），还是自身免疫性疾病、心血管疾病以及癌症等，它都能大显身手。新蝶呤是由免疫细胞（主要是巨噬细胞）在干扰素 -γ 的刺激下，从鸟苷三磷酸（GTP）衍生而来的。在这个过程中，新蝶呤会被释放到生物体液里，特别是当辅助性 T 细胞和巨噬细胞参与反应时，它的浓度会显著升高。由于新蝶呤在免疫功能方面的明确作用，以及它在各种体液中的稳定性和可检测性，其在临床应用中的价值备受认可。
但现有的新蝶呤检测方法都存在一些不足。酶联免疫吸附测定（ELISA）不仅耗费人力，而且可扩展性差，动态范围窄，信号稳定性也欠佳。超高效液相色谱 - 荧光检测法（UHPLC-FLD）虽然灵敏度高，但信号变异性大。液相色谱 - 串联质谱法（LC-MS/MS）尽管选择性和灵敏度都有所提升，但已有的样本处理方法也存在通量低、对内源性新蝶呤考量不足等问题。为了解决这些难题，助力 FDA 赞助的一项临床研究（NCT04183491），研究人员开展了一项针对新蝶呤绝对定量的研究。他们开发并验证了一种基于替代基质技术的高通量 LC-MS/MS 方法，用于检测和定量人血清中的新蝶呤。该研究成果发表在《Analytical Biochemistry》上，为药物研发和临床研究提供了有力支持。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：采用 LC-MS/MS 技术进行新蝶呤的检测与定量，在实验过程中对质谱仪参数（如碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）、入口电压（EP）和碰撞池出口电压（CXP））进行了优化。在样本处理方面，使用了替代基质技术，以胎牛血清（FBS）作为人血清的替代基质进行相关实验。
下面来看看具体的研究结果：
- 基质适用性评估 - 平行性实验：研究人员通过平行性实验评估替代基质的适用性。实验发现，胎牛血清（FBS）和血清的斜率相同，均为 0.0145。而且，通过 X 轴截距的差异，能够准确预测内源性新蝶呤的含量，其值为 1.0 ng/mL。这表明 FBS 和血清在新蝶呤检测方面具有相似的反应特性，为 FBS 作为替代基质提供了有力证据。
- 精密度和准确度评估：在不同替代质量控制（QC）水平下，日间准确度范围为 92.08 - 109.06%，精密度范围为 3.36 - 16.00%；在研究基质中的 QC 样本，日间准确度范围为 96.81 - 108.86%，精密度范围为 4.13 - 6.01%。这些数据说明该检测方法在不同条件下都能保持较好的精密度和准确度，检测结果可靠。
- 内标响应评估：进一步研究发现，胎牛血清（FBS）中的内标响应与血清相比，仅相差 6.9%。这再次证明了 FBS 作为替代基质的可行性，在检测过程中，其对内标响应的影响较小，不会干扰新蝶呤的定量分析。
- 其他影响因素评估：研究人员还对可能影响检测结果的其他因素进行了考察，结果显示未观察到基质效应、进样残留和交叉分析物干扰。这表明该检测方法具有较高的特异性和稳定性，能够准确地检测出新蝶呤的含量。
- 自动化适应性评估：最后，研究人员对该方法进行了自动化适应性评估，结果表明该高通量方法能够轻松适应自动化操作。这大大提高了样本处理和检测的效率，为大规模临床样本分析提供了便利。
研究结论表明，通过对精密度和准确度数据、内标响应数据的分析，以及良好的平行性实验结果，充分证明了胎牛血清（FBS）是一种适合替代人血清的基质，在优化条件下可用于支持新蝶呤的分析。同时，该高通量方法能够方便地实现自动化，提高了检测效率。这项研究成果意义重大，它成功解决了内源性生物标志物新蝶呤定量分析的难题，为 FDA 赞助的临床研究提供了可靠的检测方法，有助于准确评估药物的药效学作用。而且，该研究建立的方法和验证策略，也为其他内源性生物标志物的定量分析提供了参考范例，推动了生物分析领域的发展，为未来药物研发和临床诊断的精准化提供了重要的技术支撑。
