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本文是关于磷酸果糖激酶（PFK）超家族的综述。文章介绍了 PFK 存在于两个非同源超家族，重点阐述了含 Rossmann 折叠的 PFK 超家族的多样性，涵盖结构、功能、调控机制、进化等方面，还探讨了其在疾病和药物研发中的应用。
引言：教科书式的结构 - 功能关系
6 - 磷酸果糖激酶（PFK）于近 90 年前被发现，它能将 d - 果糖 6 - 磷酸磷酸化，生成 d - 果糖 1,6 - 二磷酸，这一过程在阐明糖酵解的 Embden-Meyerhof-Parnas 途径中具有重要意义。最早被鉴定的 PFK 以 ATP 为磷酸供体，属于 EC 2.7.1.11 类，在糖酵解通量控制中发挥关键调节作用，是协同动力学和变构调节的典型例子。
通过 X 射线晶体学和定点诱变研究，人们对 PFK 的结构和催化机制有了深入了解。其亚基包含两个 Rossmann 折叠结构域，较大结构域结合底物 ATP，较小结构域结合 F6P，F6P 结合结构域还含有变构效应物结合位点。研究揭示了关键活性位点残基，确定了磷酸转移的催化机制，即 F6P 的 1 - 羟基直接亲核攻击 ATP 的 γ- 磷酸，天冬氨酸（如 EcoPFK 中的 Asp127）作为一般碱催化剂，通过夺取质子增加 F6P 羟基的亲核性。
此外，研究还发现细菌 ATP 依赖的 PFK 存在活性的高亲和力 R 状态和变构抑制的 T 状态，R-to-T 转变与亚基二聚体的刚性体旋转有关，这种转变会改变亚基界面的相互作用，并传递到活性位点，影响 F6P 的结合亲和力。
然而，PFK 酶在结构、功能和调节机制上存在比经典研究和教科书所展示的更多样性，本文旨在区分 PFK 的两个非同源超家族，并总结其中主要超家族的多样性。
PFKs 存在于两个非同源超家族
本文重点关注广泛分布、含 Rossmann 折叠的 PFK 超家族（在 InterPro 数据库中编号为 IPR035966，有时也称为 PFKA 家族）。同时，还有另一类 PFK，即 PFKB 家族，它属于核糖激酶样超家族（InterPro 编号为 IPR029056），包含大肠杆菌的次要 ATP 依赖的 PFK（PFK-2）、古细菌的 ADP 依赖的 PFK 等多种酶。
磷酸果糖激酶超家族的复杂世界
系统发育分析表明，磷酸果糖激酶超家族成员有共同的进化祖先，但复杂的进化模式使超家族成员在特异性、调节和结构特征上呈现出显著多样性，这使得对该超家族的分类和组织变得复杂。
根据磷酸供体的不同，超家族可分为两类。1974 年发现变形虫 Entamoeba histolytica 的 PFK 以无机焦磷酸（PPi）为磷酸供体，此后在植物、厌氧细菌、古细菌和单细胞真核生物中也发现了更多 PPi依赖的 PFK，它们属于 EC 2.7.1.90 类。
许多真核生物的 ATP 依赖的 PFK 比细菌同源物更复杂，这是由于祖先 pfk 基因的复制和串联融合，使得真核基因长度约为细菌的两倍，后续不同真核生物谱系中的基因复制又产生了同源亚基类型和组织特异性同工型。例如，酵母 PFK 多为同源 α 和 β 亚基的异源寡聚体，哺乳动物有肝、肌肉和血小板特异性的 PFK 同工型（PFKL、PFKM 和 PFKP），北方红橡树全基因组复制产生了三对 pfk 旁系同源物，酵母 PFK 还发生了额外的基因融合事件。
通过系统发育分析，研究人员定义了多个单系序列组，但 PFK 的系统发育与物种的系统发育并不匹配，水平基因转移普遍存在，这也导致了序列数据库中分类的混乱，基于序列的分类难以准确区分不同的 PFK 家族。
功能、调节和生理作用的多样性
过去九十年对数百种 PFK 进行了生化表征。通过对 BRENDA 数据库中 PFK 稳态动力学参数的分析发现，ATP 依赖和 PPi依赖的 PFK 在周转数（kcat）和两个米氏常数（KM，分别针对 F6P 和磷酸供体）的范围上非常相似，且与其他酶相比，PFK 的周转数较高，米氏常数处于平均水平。
在变构调节方面，细菌 ATP 依赖的 PFK 通常被 ADP 激活，被磷酸烯醇式丙酮酸抑制，部分还受 PPi抑制，但不同细菌的 PFK 对效应物的敏感性存在差异。真核生物 ATP 依赖的 PFK 变构调节更为复杂，已鉴定出 20 多种效应物，如 AMP、果糖 2,6 - 二磷酸是重要的生理激活剂，ATP 既是底物又是变构抑制剂，近期新的质谱方法还发现了更多潜在的变构效应物。而许多 PPi依赖的 PFK，尤其是细菌来源的，是非变构的，但果糖 2,6 - 二磷酸可激活植物中的 PPi依赖的 PFK，AMP 可激活变形虫 Naegleria fowleri 的该酶。
磷酸供体的不同对代谢和生理有重要影响。ATP 依赖的 PFK 催化的反应在体内几乎不可逆，而 PPi依赖的 PFK 催化的反应标准吉布斯自由能较小，使得糖酵解途径更接近热力学平衡，该酶可在正向和反向反应中发挥作用。具有可逆的 PPi依赖的 PFK 的生物体可能将其用于糖酵解和糖异生，但目前尚未确定是否有生物体以此为主要方式。
此外，PPi依赖的 PFK 还有其他生理作用。在一些缺乏转醛醇酶的生物中，它可磷酸化 d - 景天庚酮糖 7 - 磷酸，参与戊糖磷酸途径的变体；部分 PPi依赖的 PFK 还能维持 PPi稳态，如在 Acetivibrio thermocellus 和寄生虫 Toxoplasma gondii 中，该酶对维持细胞正常功能至关重要。
深入探究 ATP 依赖的 PFK 的结构世界
目前，蛋白质数据库（PDB）中有 45 个磷酸果糖激酶超家族酶的结构，其中 40 个是 ATP 依赖的 PFK，仅 5 个是 PPi依赖的 PFK，且这些结构仅来自 14 种不同的生物。
在 ATP 依赖的 PFK 中，18 个来自 5 种细菌的结构具有相同的架构，每个酶都是同源四聚体，亚基结构相似。GstPFK 是重要的范例，其结构研究证实了生理相关的变构调节剂 ADP 和磷酸烯醇式丙酮酸分别在 R 状态和 T 状态下占据相同的效应物结合位点。
另一组 ATP 依赖的 PFK 结构来自酵母、哺乳动物等真核生物。由于进化历史中的串联重复，它们的亚基长度为 750 - 1000 个残基。酵母酶以活性异源寡聚体形式被解析，如 KpaPFK 是 (αβγ)4十二聚体，其 γ 亚基可能由古老的 S - 腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶进化而来。
人类 PFK 的结构研究也取得了进展，如 PFKM、PFKP 和 PFKL 的结构相继被报道，其中 PFKL 是通过冷冻电镜解析的。真核生物 ATP 依赖的 PFK 亚基包含四个 Rossmann 折叠，N 端两个折叠包含活性位点，底物结合模式与细菌酶相似，C 端部分虽失去催化活性，但对稳定性和复杂的变构调节很重要，还进化出了新的效应物结合位点。
通过对人类 PFKL 的 R 状态和 T 状态结构研究，揭示了 R - to - T 转变的关键细节，如 7° 旋转会破坏 F6P 结合部分的活性位点，T 状态下 ATP 结合到效应物位点 3 会导致 α 螺旋局部展开和精氨酸残基位置改变，影响 F6P 结合口袋。此外，还明确了 C 末端尾巴在调节中的作用，其磷酸化可能促进向活性 R 状态的转变。
布氏锥虫 PFK：独特结构使其成为新型药物靶点
布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的 PFK（TbrPFK）是一种特征明确的真核 ATP 依赖的 PFK，其结构已被解析。它与其他真核 ATP 依赖的 PFK 不同，不是基因复制的产物，在序列上更接近 PPi依赖的 PFK，还含有独特的结构元件，如新颖的 N 端结构域、额外的环和 C 末端延伸。
TbrPFK 的唯一已知变构激活剂是 AMP，它与 ATP 依赖的细菌 PFK 的效应物结合位点相同，但结合方向旋转了 180°。由于布氏锥虫在血液中的形式完全依赖糖酵解产生 ATP，其糖酵解酶成为药物靶点。基于 TbrPFK 的独特结构，研究人员开发了一系列变构抑制剂，这些抑制剂能有效抑制 TbrPFK，在小鼠模型中清除寄生虫的效果优于现有药物，且对人 PFK 抑制作用不明显。
PPi依赖的 PFK：修饰结构和对磷酸供体特异性的见解
目前 PDB 中有 5 个 PPi依赖的 PFK 结构，分别来自细菌和原生动物。这些酶具有与 ATP 依赖的细菌同源物相似的两个 Rossmann 折叠架构，但存在多种插入和延伸，使其亚基更大。
以引起莱姆病的病原体 Borrelia burgdorferi 的 PPi依赖的 PFK（BbuPFK）为例，它是高度修饰的同源二聚体，其两个 Rossmann 折叠结构域与 EcoPFK 相似，但 N 端和 C 端有延伸，C 端延伸破坏了 EcoPFK 的效应物结合位点，还含有一个新的结构域，其 β 发夹结构对 PPi特异性起重要作用。
BbuPFK 的结构还揭示了磷酸供体特异性的相关特征，如特定的氨基酸序列基序（如 GGDD、PKTIDXD）和氨基酸残基（如 Asp177、Lys203、Asn181）在阻止 ATP 结合、确保 PPi正确结合和催化过程中发挥关键作用。
另一种 PPi依赖的 PFK，来自原生动物 Trichomonas vaginalis 的 TvaPFK，其结构中含有额外的螺旋，形成了与 AMP 结合的位点，该位点可能与真核 ATP 依赖的 PFK 中的某些效应物位点类似，这为进一步研究 PPi依赖的 PFK 的调节机制提供了线索。
祖先 PFK 的本质
关于磷酸果糖激酶超家族共同祖先的性质存在争议。一方面，像 EcoPFK 这样的 ATP 依赖的细菌酶亚基最小，早期的系统发育研究认为祖先 PFK 是 ATP 依赖的；另一方面，EcoPFK 的变构调节是衍生特征，且 PPi依赖的 PFK 在厌氧生物中广泛存在，在原始厌氧环境中具有优势，因此有人认为祖先 PFK 是非变构的、PPi依赖的。
在真核生物中，有证据表明进化过程中频繁发生磷酸供体的切换，如 EhiPFK 通过单点突变可获得利用 ATP 的活性，TbrPFK 则从 PPi依赖的祖先进化而来。考虑到糖酵解和糖异生是古老的代谢途径，PPi依赖的 PFK 在发酵代谢中的优势，以及原始细胞基因组小、酶种类有限，多功能的 PPi依赖的 PFK 更符合祖先特征，但目前 PPi依赖的 PFK 结构研究较少，进一步探索有助于揭示其进化路径。
未来方向：多样性、动力学、疾病和药物
目前，虽然在 BRENDA 和 PDB 中已有数百个 PFK 的功能参数和数十个结构信息，但仍有许多问题待解答，也存在诸多研究机遇。
在结构研究方面，目前的结构知识存在分类学偏差，植物和古细菌中的 PFK 结构尚未确定，细菌结构也仅来自少数几个门。新的结构研究有望揭示更多的结构变化，为理解生物适应环境的机制提供线索。
分子动力学等计算方法在研究 PFK 的变构调节方面取得了进展，结合更强大的分子动力学模拟，能够更深入地了解变构转变的时空细节，为设计具有特定功能的蛋白质提供可能，在代谢工程中具有重要应用潜力。
在医学领域，PFK 与多种疾病相关。如 Tarui 病与骨骼肌中 PFK 活性缺失有关，癌症、糖尿病和阿尔茨海默病等疾病中存在葡萄糖代谢失调，PFK 在其中发挥重要作用。基于 PFK 结构研究，可对疾病相关突变进行分析，为开发治疗药物提供依据。目前已发现一些针对 PFK 的小分子，可调节其活性，为治疗相关疾病提供了新的方向。
总之，过去 90 年对磷酸果糖激酶超家族的生化研究取得了很大进展，但由于其结构和功能的多样性以及在代谢网络中的关键作用，仍有许多未知等待探索。
