单分子荧光显微技术揭示人源小热休克蛋白与聚集倾向性客户蛋白的动态互作机制

为解决蛋白质错误折叠导致的聚集问题，澳大利亚研究团队利用全内反射荧光显微镜（TIRF）实时观测人源小热休克蛋白（sHsps）αB-晶状体蛋白（αB-c/HSPB5）和Hsp27（HSPB1）与荧光素酶（FLUC）、硫氰酸酶（rhodanese）等客户蛋白的早期互作。研究发现αB-c通过持续招募亚基形成大复合体抑制聚集，而Hsp27则以更短暂的方式结合，揭示了sHsps维持蛋白质稳态（proteostasis）的异质性机制，为神经退行性疾病和白内障等蛋白质聚集相关疾病的治疗提供新思路。

　　

在细胞中，蛋白质错误折叠引发的异常聚集与阿尔茨海默病、白内障等多种疾病密切相关。小热休克蛋白（small heat shock proteins, sHsps）作为一类重要的分子伴侣，能够通过结合错误折叠蛋白阻止其聚集，但因其动态异质性特点，其作用机制一直未被阐明。尤其对于人源sHsps中的αB-晶状体蛋白（αB-c/HSPB5）和Hsp27（HSPB1），它们虽被证实与神经退行性疾病和眼晶状体病变相关，但二者如何识别不同客户蛋白并形成复合体的动态过程仍是未解之谜。

为破解这一难题，澳大利亚的研究团队在《Biochemical Journal》发表了一项创新研究。他们采用全内反射荧光显微镜（TIRF）技术，首次在单分子水平实时追踪了αB-c和Hsp27与三种易聚集客户蛋白（荧光素酶FLUC、硫氰酸酶rhodanese和氯离子通道蛋白CLIC）的互作过程。研究通过光漂白步进计数法量化复合体 stoichiometry（化学计量比），结合疏水性探针bis-ANS分析客户蛋白构象变化，并利用化学交联稳定瞬态互作以捕捉早期复合体。

αB-c通过亚基持续招募抑制客户蛋白聚集
研究发现，αB-c会优先结合FLUC的寡聚体，初期形成1:0.08的低化学计量比复合体，1小时内迅速增至1:2.5。随着时间推移，更多αB-c亚基被招募至复合体，最终形成含13个αB-c亚基的大型结构，完全包裹客户蛋白。这种"种子扩展"机制有效阻止了FLUC进一步聚集，但过量亚基的包裹可能导致复合体无法被后续检测技术捕获。

Hsp27展现动态互作特性
相比之下，Hsp27与FLUC的结合更为短暂：初期40%的FLUC分子被Hsp27结合，但1小时后复合体比例降至17%。尽管Hsp27也能招募额外亚基（从1:0.68增至1:1.75），但其复合体始终比αB-c小50%，且部分客户蛋白会从复合体中解离。这种动态特性可能有助于后续Hsp70系统对客户蛋白的再折叠。

客户蛋白特性决定复合体异质性
通过bis-ANS检测发现，rhodanese在加热1小时内疏水性增加10倍于FLUC，这与Hsp27更易与其形成稳定复合体（40%结合率）的现象一致。而CLIC在变性后疏水性反而降低，导致两种sHsps都仅能与其形成少量复合体（15-20%结合率）。这表明客户蛋白的构象变化直接影响sHsps的结合模式。

非复合体客户蛋白的命运
有趣的是，即使存在sHsps，仍有部分客户蛋白未形成复合体。αB-c存在时，这些"游离"的FLUC会持续聚集至8聚体；而Hsp27存在时，游离FLUC却能保持较小寡聚状态（<5聚体），暗示Hsp27可能通过短暂结合抑制了聚集进程。

这项研究首次在单分子层面揭示了sHsps作用机制的共性与特性：二者均通过小亚基（单体/二聚体）识别早期聚集态客户蛋白，但αB-c倾向于构建大型稳定复合体，而Hsp27则保持动态互作。该发现不仅深化了对蛋白质稳态调控的理解，还为设计针对sHsps异常相关疾病（如HSPB1突变导致的腓骨肌萎缩症和HSPB5突变导致的白内障）的干预策略提供了理论依据。特别值得注意的是，研究建立的单分子TIRF技术突破了传统方法（如尺寸排阻色谱和免疫共沉淀）只能检测终末复合体的局限，为研究其他动态蛋白互作系统提供了新范式。