基于SpyTag-SpyCatcher组装与有机硅固定化的β-葡萄糖醛酸酶工程化改造提升甘草酸水解效率

本研究针对β-葡萄糖醛酸酶（GUS）在工业应用中存在的热稳定性差、成本高等问题，通过SpyTag-SpyCatcher介导的蛋白质组装技术构建高阶PGUS复合体，并结合有机硅网络（OSN）固定化策略，显著提升了酶的热稳定性（1.7-2.5倍）和操作稳定性（10次循环保留67%活性），为甘草酸（GL）的高效生物转化提供了可持续解决方案。

　　

甘草酸（GL）作为甘草中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒等药理作用，但其生物利用度受限于亲水性糖苷结构。β-葡萄糖醛酸酶（GUS）能水解GL生成吸收效率更高的甘草次酸（GA），但天然酶的热稳定性差制约了工业化应用。高温可提升反应效率并降低微生物污染风险，但酶在高温下易失活，传统固定化方法又面临活性损失问题。如何平衡酶的稳定性与活性，成为生物催化领域的关键挑战。

来自中国的研究团队在《Biochemical Engineering Journal》发表研究，创新性地将蛋白质共价组装与细胞表面固定化技术相结合。通过SpyTag-SpyCatcher分子工具将米曲霉来源的PGUS四聚体组装成高阶结构，并利用正硅酸乙酯（TEOS）和氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）在大肠杆菌表面构建有机硅网络（OSN）保护层，实现了酶热稳定性与操作稳定性的协同提升。

关键技术包括：1）基于结构生物学的PGUS组装位点理性设计；2）SpyTag-SpyCatcher介导的细胞内共价组装；3）TEOS/APTES共沉淀法制备OSN包被的全细胞催化剂；4）以对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛苷（pNPG）和甘草酸铵为底物的酶活检测体系。

【SpyTag-SpyCatcher mediated PGUS assembly】
通过分析PGUS的晶体结构（PDB 5C71），发现其由糖结合域（SBD）、免疫球蛋白样结构域（ISD）和(β/α)₈-TIM桶状催化域构成。研究团队在C端或N端融合SpyTag/SpyCatcher模块，构建了二聚体、四聚体及高阶组装体。其中C端融合策略使酶在60℃下的半衰期延长2.5倍，且比活保持在野生型的92%。

【Conclusions】
双级稳定策略突破了传统酶工程的局限性：1）细胞内共价组装精确控制酶分子空间排列，减少热致解聚；2）OSN涂层提供物理保护并防止酶泄漏，使固定化效率达85%。该体系在连续10批次反应后仍保持67%活性，远优于游离酶固定化（19%），且能耐受60℃高温处理。

这项研究的意义在于：1）为寡聚酶的热稳定性改造提供了位点特异性组装范式；2）开创了"细胞内组装-细胞外固定"的协同稳定新策略；3）建立的OSN包被技术成本低廉且易于规模化，为GL工业化水解提供了绿色工艺。研究团队指出，该技术平台可扩展至其他多亚基酶的系统改造，推动工业生物催化从实验室走向实际应用。