化学空间拓展新策略：基于反应通量偏离（RFD）法创制真菌聚酮新分子

天然产物（NPs）研究面临已知化合物重复分离问题。研究人员开展基于反应通量偏离（RFD）策略拓展真菌聚酮化学空间的研究，从突变体中得到新分子，它们具有抗炎活性。该策略有助于药物或农药研发。

　　在生命科学和健康医学领域，天然产物（NPs）一直是医药和农药的重要来源。它们是由植物、微生物和动物在生理环境中生物合成的低分子量有机化合物。这些神奇的化合物展现出各种各样意想不到的生物学功能和独特的分子结构，数千年来一直启发着医学和化学领域的探索。到如今，许多化学家都致力于在实验室中重现其丰富的结构多样性和复杂性，期望解决样品供应问题，推动它们在医药、农药和材料等工业领域的应用。事实上，超过一半的上市小分子药物都得益于天然产物，而且基于天然产物或其衍生物的候选药物也在不断增加，逐渐进入临床试验阶段。

然而，随着对遵循天然生物合成逻辑的天然产物研究日益深入，一个棘手的问题出现了 —— 已知化合物的频繁重新分离。这就好比在一片已经被反复挖掘过的土地上寻找新宝藏，难度越来越大。同时，虽然科学家们通过优化发酵条件的 “一种菌株多种化合物”（OSMAC）策略、利用表观遗传操作、基因激活和基因组挖掘等方法来发现新的天然产物，但这些方法在突破天然生物合成逻辑的限制、探索自然界进化出的生物合成能力边界之外的分子多样性方面，仍存在很大的局限性。

为了突破这些困境，来自未知研究机构的研究人员开展了一项极具创新性的研究，相关成果发表在《Bioorganic Chemistry》杂志上。他们另辟蹊径，提出了一种基于反应通量偏离（RFD）的全新策略，旨在打破天然生物合成机器的固有局限，让其能够制造出超出天然产物化学空间边界的非天然分子。

研究人员在研究过程中用到了多种关键技术方法。在化合物结构鉴定方面，利用核磁共振光谱（NMR spectra），在 DMSO-d₆溶剂中，以 TMS 为内标，分别在 500MHz 和 125MHz 频率下观测¹H 和¹³C 原子核，以此来确定分子结构；还借助 X 射线晶体学分析（X-ray crystallographic analysis），在 173K 的条件下，使用 Bruker APEX-II CCD 探测器和石墨单色化的 Cu-Kα 辐射（λ = 1.54178 ?）获取晶体数据。为了确定参与反应的关键酶，研究人员进行了 BLAST 分析，对潜在的酶进行异源过表达，并开展基于纯蛋白的转化实验。

下面我们来详细看看研究结果：

• 4HN 相关反应通量及其底物可切换性：研究发现，1,3,6,8 - 四羟基萘（4HN）和 2 - 乙酰基 - 1,3,6,8 - 四羟基萘（A4HN）是生成多种聚酮化合物的关键中间产物。研究人员尝试在野生型真菌菌株中用 4HN 的同分异构体（isostere）拉索酸（lawsone）替代 4HN，测试其底物可切换性，但拉索酸相关产物含量极少甚至无法检测到。推测这是因为 4HN 在细胞内的表达和运输更具优势。
• 新分子的发现与结构解析：研究人员在Daldinia eschscholzii的?pksTL突变体（该突变体中pksTL基因缺失）培养物中添加拉索酸，成功得到了两种结构前所未有的萘醌 - 色满杂合体 ——daleslawsones A 和 B。通过光谱分析和 X 射线晶体学分析，确定它们具有未预测到的 6/6/5/6/6 五环分子框架。这种独特的碳骨架是由拉索酸与真菌天然生物合成中间产物 1 - (2,6 - 二羟基苯基) 丁 - 2 - 烯 - 2 - 酮通过共价偶联形成的，并且该过程经由双环 [3.2.1] 辛烷 - 2,8 - 二酮亚结构介导。在双酮系统中，环戊酮（而非环己酮）部分通过自发缩酮化形成 daleslawsone B，还可通过酶促还原生成 daleslawsone A 的环戊醇核心。
• 关键酶的确定：研究人员通过 BLAST 分析、潜在酶的异源过表达和基于纯蛋白的转化实验，鉴定出两种能够促进酮还原的酮还原酶，分别是DeAKR（一种醛酮还原酶（AKR））和De3HNR（一种三羟基萘还原酶）。
• 生物活性研究：daleslawsones A 和 B 在脂多糖诱导的 RAW264.7 细胞中表现出抗炎活性，且这种活性具有手性依赖性，(-)-daleslawsone A 的活性比其他立体异构体更强。

研究结论表明，基于反应通量偏离（RFD）的策略成功实现了让天然生物合成机器制造出非天然分子的目标，突破了天然产物化学空间的限制。从?pksTL突变体培养物中得到的 daleslawsones A 和 B，不仅具有全新的分子结构，还展现出良好的抗炎活性。这一策略为药物和农药的研发开辟了新的道路，能够帮助科学家们获得自然界中不存在且难以合成的化合物，为后续的创新药物和高效农药开发提供了更多可能，对生命科学和健康医学领域的发展具有重要意义。同时，该研究也为拓展天然产物的研究边界提供了新的思路和方法，有望推动相关领域在未来取得更多突破性进展。