NADPH 氧化酶调控杨树溃疡病菌致病机制的突破性发现 —— 为森林病害防治开辟新路径

杨树溃疡病由金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）引起，给杨树人工林带来巨大损失。研究人员针对 NADPH 氧化酶（NOXs）在该病菌中的作用展开研究。结果发现，NOXs 对病菌的氧化还原稳态、线粒体完整性和致病性至关重要。这为防治杨树溃疡病提供了新方向。

　　在广袤的杨树人工林中，一场悄无声息的灾难正威胁着杨树的生存。杨树溃疡病，由金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）引发，如同隐藏在树林中的 “杀手”，肆意侵害着杨树的枝干，造成树皮出现大片坏死溃疡，严重时甚至导致树木死亡。这不仅给木材生产带来巨大损失，也对生态环境造成了负面影响。然而，目前针对这种疾病，有效的防治策略却十分匮乏。为了深入了解病菌的致病机制，找到防治的新突破口，北京林业大学的研究人员勇敢地踏上了探索之旅，他们将目光聚焦在 NADPH 氧化酶（NOXs）上，试图揭开其在病菌致病过程中的神秘面纱。
这项研究成果发表在《Stress Biology》杂志上，为杨树溃疡病的防治带来了新的希望。研究人员主要运用了基因敲除技术、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术以及多种生理指标检测技术。通过基因敲除技术构建相关基因的缺失突变体和互补菌株；利用 qRT-PCR 技术检测基因表达水平；借助多种生理指标检测技术测定活性氧（ROS）水平、抗氧化酶活性、Ca²⁺含量等。

NOXs 对 C. chrysosperma 致病力至关重要

研究人员通过 Blastp 分析获得了 C. chrysosperma 基因组中 NOXs 的三个同源序列，命名为 CcNox1、CcNox2 和 CcNoxR 。qRT-PCR 检测发现，在病菌感染过程中，这三个基因的表达均显著上调。构建缺失突变体和互补菌株并进行致病性检测后发现，与野生型菌株 CN-1 相比，缺失任何一个 NOX 基因都会导致病菌对杨树枝条的致病力显著下降，表明 NOXs 在病菌致病过程中发挥着重要作用。

CcNox1 和 CcNoxR 参与菌丝生长、产孢和抗氧化应激反应

对突变体菌株的表型分析显示，ΔCcnox1 菌株的菌丝生长略有增加，ΔCcnoxr 菌株的菌丝生长则显著下降，而 ΔCcnox2 菌株的菌丝生长与 CN-1 无明显差异。此外，ΔCcnox1 和 ΔCcnoxr 菌株完全丧失了产孢能力。在氧化应激条件下，突变体菌株对过氧化氢（H₂O₂）的敏感性显著低于 CN-1，且在氧化应激处理下，CN-1 中 CcNox1、CcNox2 和 CcNoxR 的表达均显著下调。这表明 CcNox1 和 CcNoxR 对病菌的菌丝生长、产孢和抗氧化应激反应具有重要作用。

缺失 CcNox1 或 CcNoxR 导致内源性 ROS 水平升高和 CcNox2 高表达

通过 NBT 染色和 DCFH-DA 荧光探针检测发现，ΔCcnox1 和 ΔCcnoxr 突变体菌株产生的超氧阴离子和 H₂O₂明显多于 CN-1，而 ΔCcnox2 突变体菌株与 CN-1 相似。进一步研究发现，ΔCcnox1 和 ΔCcnoxr 菌株中 SOD 和 CAT 的酶活性以及相关基因的表达均显著降低。同时，在 ΔCcnox1 和 ΔCcnoxr 突变体中，CcNox2 的表达分别上调了 7.4 倍和 3.6 倍。过表达 CcNox2 的菌株（OE-Ccnox2）也表现出 ROS 水平升高、抗氧化酶活性降低、无法产孢和致病力显著下降的表型。这些结果表明，CcNox1 和 CcNoxR 在调控细胞内 ROS 产生中起主要作用，且它们与 CcNox2 之间存在补偿机制。

缺失 CcNox1 或 CcNoxR 导致 Ca²⁺内流和氧化还原稳态破坏

研究发现，ΔCcnox1、ΔCcnoxr 和 OE-Ccnox2 菌株的菌丝中游离钙离子（Ca²⁺）含量显著升高，且在高浓度 CaCl₂条件下，这些菌株的生长受到明显抑制。同时，ΔCcnox1、ΔCcnoxr 和 OE-Ccnox2 菌株的 GSH/GSSG 比值显著升高，MDA 含量也显著增加，表明细胞处于严重的氧化应激状态。这说明 CcNox1 和 CcNoxR 主要参与维持 Ca²⁺和氧化还原稳态。

CcNox1 和 CcNoxR 是线粒体结构完整性所必需的

通过透射电子显微镜（TEM）观察发现，与 CN-1 相比，ΔCcnox1、ΔCcnoxr 和 OE-Ccnox2 菌株的线粒体明显肿胀，且在菌丝尖端聚集。用 TMRE 荧光探针检测线粒体膜电位，发现 ΔCcnox1 和 ΔCcnoxr 菌株的线粒体膜电位显著下降。这些结果表明，CcNox1 和 CcNoxR 对维持线粒体的完整性至关重要。

CcNox1 和 CcNoxR 参与 OA 生物合成

研究表明，在感染早期，C. chrysosperma 通过产生草酸（OA）促进致病过程。ΔCcnox1、ΔCcnoxr 和 OE-Ccnox2 菌株的 OA 产量显著降低，OA 合成相关基因 CcOah 的表达也显著下调。外源性添加 OA 和柠檬酸（CA）可以恢复这些突变体的致病力缺陷。此外，接种突变体菌株后，杨树叶片中 ROS 产生增加，防御相关基因表达上调。这表明 NOXs 参与了 C. chrysosperma 与杨树的互作过程，影响 OA 生物合成和致病力。

在讨论部分，研究人员指出，与农作物病原菌的研究相比，木本植物与病原菌互作的机制还知之甚少。他们的研究首次揭示了 NOXs 在维持真菌线粒体完整性方面的作用，为深入理解丝状真菌中 NOXs 的功能提供了新视角。此外，靶向 NOXs 的杀菌剂可能为杨树溃疡病的防治提供新的潜在途径。这项研究成果为森林病理学的发展做出了重要贡献，为未来杨树溃疡病的防治提供了理论依据和新的策略方向，有望在实际应用中发挥重要作用，守护杨树人工林的健康生长。