探秘绿针假单胞菌亚种橙色变种 PB-St2 中具核酸内切酶活性的推定绿脓菌素 S9：分子机制与生态功能解析

为探究绿针假单胞菌亚种橙色变种 PB-St2 产生的细菌素相关机制，研究人员开展了对推定绿脓菌素 S9c 的分子和功能分析。结果发现其具有窄谱杀菌活性，机制为金属依赖的核酸内切酶。这有助于该菌株在植物相关生境竞争，意义重大。

　　绿脓菌素（Pyocins）是一类与假单胞菌密切相关的细菌素。在本研究中，通过基因组挖掘和深入的序列分析，从绿针假单胞菌亚种橙色变种（P. chlororaphis subsp aurantiaca）PB-St2 中鉴定出 3 种类似 S9 型（a、b 和 c）、1 种 S3 型（d）和 1 种 R 型绿脓菌素系统。对 PB-St2 产生细菌素的表型筛选表明，其对密切相关的假单胞菌属物种具有窄谱杀菌活性，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAi、PAc1、PAc3、PAc4，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）Psi-RS1 和基隆假单胞菌（Pseudomonas kilonensis）OSRS3。在此，研究人员进一步选择推定的绿脓菌素 S9c 进行分子和功能表征。候选系统推定的 N 端受体结合域与来自铜绿假单胞菌的任何已表征的 HNH 型绿脓菌素 S 核酸酶（DN^ases）均无显著相似性。相反，其细胞毒性结构域与绿脓菌素 S8 有 53% 的序列相似性，与绿脓菌素 S9 有 70% 的序列相似性。因此，绿脓菌素 S9c 被认为是绿脓菌素 S9 簇中 I 类核酸酶（H-N-H）家族下的一个亚型，常见于绿针假单胞菌亚种橙色变种和绿针假单胞菌亚种金色变种（P. chlororaphis subsp aureofaciens）菌株中。对绿脓菌素 S9c 系统的分子筛选显示，在从不同植物宿主分离的 7 株绿针假单胞菌亚种橙色变种菌株（GS1、GS3、GS4、GS6、ARS38、FS2）和 1 株绿针假单胞菌 RP4 相关菌株中，有 6 株含有该系统。将绿针假单胞菌亚种橙色变种 PB-St2 中绿脓菌素 - 免疫操纵子（S9c）的两个结构基因组成的 1.59 kb 片段克隆到 pET28a (+) 载体中，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 DE3（pLysS）菌株中表达为带有组氨酸标签的融合蛋白。利用 N 端 His 标签纯化了绿脓菌素 S9c 操纵子的重组细胞毒性蛋白，其分子量约为 50 kDa。通过串联质谱分析确认了目标蛋白的身份。纯化的细胞毒性蛋白对绿针假单胞菌亚种橙色变种 GS7 具有活性，最低抑菌浓度为 12.5 μg/ml。通过对 pTZ57R 质粒亚型的非特异性水解证据，证实了其细胞毒性机制为金属依赖性核酸内切酶。这些结果表明，绿脓菌素 S9c 有助于该菌株在与植物相关的自然生境（被相关假单胞菌属菌株占据）中的根际竞争能力。