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巨噬细胞在再生医学和癌症免疫治疗等领域极具潜力，但基因递送载体引发的炎症反应影响其应用。研究人员构建炎症诱导报告载体，开展巨噬细胞基因递送载体筛选研究。结果显示该方法能有效评估载体影响，为筛选新型载体提供工具1217。
在生命的微观世界里，巨噬细胞是一群极为活跃且重要的 “守护者”。它们不仅肩负着抵御外来病原体入侵的重任，还在维持身体各器官和组织的内环境稳定方面发挥着关键作用。在肿瘤的战场上，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）却如同 “双面间谍”，一方面促进肿瘤的转移、免疫抑制、侵袭和血管生成；另一方面，在再生医学领域，巨噬细胞又成为修复受损组织的 “生力军”，从炎症初期清除异物，到招募免疫细胞，再到后期促进愈合，都离不开它们的身影
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然而，巨噬细胞的 “多面性” 也带来了难题。当利用基因编辑技术对巨噬细胞进行改造，用于治疗各种疾病时，基因递送载体的选择成为了关键。许多病毒和非病毒递送载体在进入巨噬细胞时，会引发炎症反应。对于癌症免疫治疗而言，炎症性巨噬细胞或许是有益的，可在再生医学中，如慢性伤口愈合、骨骼肌损伤修复、心肌梗死治疗以及肝脏和大脑损伤修复等场景下，炎症性巨噬细胞表型却会阻碍愈合过程56。
为了解决这一困境，来自美国阿肯色大学（University of Arkansas）的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发一种能够快速、准确评估不同基因递送载体对巨噬细胞炎症反应影响的方法，从而为筛选出更合适的载体提供有力依据。这项研究成果发表在《BMC Methods》杂志上，为该领域的发展带来了新的曙光18。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。他们首先构建了稳定表达炎症报告基因的细胞系，将编码红色荧光蛋白（mRFP1）的基因置于炎症诱导型启动子的控制之下，该启动子含有多个核因子 κB（NF-κB）转录因子结合位点 ，可在炎症反应发生时，通过 NF-κB 信号通路的激活，促进 mRFP1 的表达。之后，研究人员利用慢病毒转导技术将构建好的报告质粒导入 RAW264.7 小鼠巨噬细胞系中，获得稳定表达的细胞株。同时，运用流式细胞术、免疫染色和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，对细胞的炎症反应、表面标志物表达以及肿瘤坏死因子 α（TNF-α）的释放水平进行检测分析378。
下面让我们来详细看看研究结果。
- 炎症报告基因的特性：研究人员成功构建了炎症报告质粒，并将其稳定整合到 RAW264.7 细胞中，获得了 RAW264.7 炎症报告细胞（RAW264.7-IRCs）。通过脂多糖（LPS）刺激实验，发现该报告基因在 0.1 - 1 ng/mL 的 LPS 浓度范围内呈现出良好的动态响应，其 mRFP1 表达水平与 TNF-α 的释放量呈线性相关，相关系数 R2 达到 0.90。这表明 mRFP1 荧光强度能够有效反映巨噬细胞的炎症反应程度910。
- 炎症报告基因的响应性：用 LPS 和干扰素 γ（IFN-γ）刺激 RAW264.7-IRCs 后，在刺激 24 小时时，mRFP1 表达显著增加；而在移除刺激物 48 小时和 72 小时后，mRFP1 表达下降，几乎与未处理细胞无异。这充分证明了该报告基因能够灵敏地响应巨噬细胞激活状态的变化，并且在刺激消除后可恢复到基线水平1112。
- 细胞表型分析：通过免疫染色和流式细胞术对 RAW264.7-IRCs 进行表型分析，发现 LPS 刺激后，细胞呈现出混合表型，同时表达促炎标记物 CD86 和抗炎标记物 CD206。不过，LPS 刺激细胞的 CD86 平均荧光强度增加，CD206 平均荧光强度降低，表明细胞更倾向于炎症表型，但 mRFP1 表达未达预期水平13。
- 不同递送载体的影响：研究人员使用 RAW264.7-IRCs 对多种病毒和非病毒递送载体进行筛选。结果显示，腺相关病毒（AAV）1、2、5、8 和 9 型中，AAV1 有少量绿色荧光蛋白（GFP）递送，其他几种几乎无递送和炎症反应；腺病毒 5/35（Ad5/35）GFP 递送效率高，但炎症反应也较强；非病毒载体脂质体 2000（Lipofectamine 2000）和 TransIT-X2 虽然 GFP 递送效率较高，但会引发显著的炎症反应1415。
在研究结论与讨论部分，此次研究构建的炎症报告基因系统为评估巨噬细胞对不同刺激的反应提供了一种灵敏且动态的筛选工具。通过该工具，研究人员能够深入了解不同基因递送载体在巨噬细胞中引发的炎症反应，为新型载体的高通量筛选奠定了基础。不过，研究也发现 RAW264.7 细胞系存在一定局限性，其基础 NF-κB 激活水平与原代巨噬细胞不同，这可能影响对实验结果的解读。因此，在后续研究中，需要进一步优化实验模型，以更准确地评估基因递送载体的效果。总体而言，这项研究为基因递送和过继细胞治疗领域提供了重要的技术支持和理论依据，有助于推动相关疗法的发展，为未来的临床应用带来新的希望1617。
