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西尼罗河病毒（WNV）在克罗地亚等地传播多年，此前因缺乏完整基因组数据限制研究。研究人员对克罗地亚 3 位患者样本进行全基因组测序与分析。结果显示不同年份毒株分属不同分支，明确了其潜在传播路线，为研究 WNV 传播动力学提供依据。
西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）作为一种由蚊子传播的黄病毒，在过去 25 年里，频繁地在北美和欧洲引发严重且反复的疫情，对公共健康构成了极大的威胁。在众多的 WNV 谱系中，1a 和 2 谱系是导致当前疫情爆发的主要 “元凶”。其中，2 谱系自 2004 年在匈牙利现身之后，便迅速在欧洲中部和南部地区扩散开来，逐渐成为当地的优势毒株。
克罗地亚自 2012 年首次发现由 WNV 引起的人类神经侵袭性疾病病例以来，每年都会有新的病例出现。然而，以往克罗地亚对 WNV 的研究仅仅局限于对 163bp 的 NS5 片段进行分析，这就好比只看到了拼图中的一小块，无法呈现出整个拼图的完整面貌，难以深入探究病毒的进化历程和传播规律。因此，获取完整的 WNV 基因组序列，对其进行深入的系统发育分析，成为了科研人员亟待解决的重要问题。
为了填补这一关键的知识空白，来自克罗地亚 “Dr. Fran Mihaljevi?” 传染病大学医院的研究人员 Barbara An?eli? Dmitrovi?、Kristian Boduli?和 Ivan - Christian Kurolt 等开展了相关研究。他们的研究成果发表在了《Virology Journal》上，为我们深入了解 WNV 在克罗地亚的传播和进化提供了宝贵的线索。
在本次研究中，研究人员运用了多种关键技术。首先，从 2016 年、2023 年和 2024 年感染 WNV 的克罗地亚患者的血清和尿液样本中提取病毒 RNA，这一步就像是从茫茫大海中捞出 “病毒宝藏”。接着，通过反转录合成双链 cDNA，为后续的研究奠定基础。之后，利用精心设计的引物对 WNV 基因组进行多重 PCR 扩增，再借助 Illumina 测序技术测定基因组序列。在得到原始数据后，使用一系列生物信息学工具，如 FastQC、Trim Galore、Bowtie2、samtools 和 SPades 等，对数据进行处理和分析，最终构建系统发育树，探究病毒之间的遗传关系。
研究结果
- 基因组测序成果：研究人员成功地从 2016 年的尿液样本和 2024 年的血清样本中获取了完整的 WNV 基因组序列，分别为 11086bp 和 10986bp；2023 年的尿液样本也贡献了 9808bp 的部分基因组序列。这些序列如同打开 WNV 秘密大门的钥匙，被存入 GenBank 数据库，为后续研究提供了重要资源。
- 序列比对与进化分支分析：经过细致的对比分析发现，2016 年的基因组与奥地利和捷克共和国报道的基因组序列相似度高达 99%，而 2023 年和 2024 年的基因组则与匈牙利的基因组序列有着 99% 的相似性。系统发育分析进一步表明，2016 年的序列属于 E 分支中的 E2 亚分支，与奥地利和匈牙利的序列聚类在一起；2023 - 2024 年的序列则属于 D 分支中的 D2.1 亚分支，与匈牙利及其他周边国家的序列归为一组。这就像是为病毒找到了各自的 “家族”，清晰地展示了它们之间的亲缘关系。
- 核苷酸差异与氨基酸替换解析：对核苷酸差异的深入研究显示，2016 年的基因组与匈牙利 2004 年的原型菌株相比，核苷酸差异为 0.46%；2024 年的基因组与原型菌株的差异为 0.82%。在对 WNV - 2 多聚蛋白的分析中，研究人员还发现了一些固定的非同义替换，这些替换就像是病毒的 “独特标记”，能够作为基于基因组的系统发育分支的区分标志。例如，在 E 分支序列中，RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）上的 A302T 替换，对酶的折叠和稳定性有着重要意义；在 D 分支中，NS3 - H253P 替换与病毒毒力和致病性的增强有关。此外，2024 年的基因组相较于 2023 年的基因组以及该亚分支之前已知的序列，还出现了两个额外的氨基酸变化（E - V324A，NS4A - V33M），这表明病毒在不断地适应环境，持续进化。
研究结论与讨论
本次研究首次成功测定了克罗地亚 WNV 的完整和近乎完整的基因组序列，这无疑是在 WNV 研究道路上迈出的重要一步。通过系统发育分析，研究人员发现克罗地亚至少存在两次 WNV 的引入事件，虽然还需要更广泛的数据来进一步确认，但这一发现为研究 WNV 的传播路径提供了关键线索。研究还证实了克罗地亚与其他西巴尔干和中欧国家一样，存在 WNV 不同分支混合传播的现象，多种分支在该地区共同流行。
从进化的角度来看，研究中发现的非同义替换意义重大。这些替换可能代表着病毒为了适应环境而发生的适应性改变，对病毒的适应性或毒力有着潜在的影响。持续对这些替换进行监测和研究，有助于我们更好地理解 WNV 的进化机制，预测病毒的发展趋势。
在地域和环境因素方面，研究表明农业活动与 WNV 的传播密切相关。克罗地亚东部地区由于其特殊的农业景观和生态环境，为 WNV 的传播创造了有利条件，这也解释了为什么该地区 WNV 的流行率较高。这一发现提示我们，在防控 WNV 传播时，不仅要关注病毒本身的生物学特性，还需要综合考虑环境和农业等多方面因素。
总体而言，本次研究成果为深入了解 WNV 在克罗地亚的传播和进化提供了坚实的基础，强调了持续进行基因组监测的重要性。通过不断地收集和分析全基因组测序数据，我们有望更有效地追踪和控制 WNV 在欧洲的传播，为保障公众健康贡献力量。
