过表达 74-kb 多杀菌素基因簇提升刺糖多孢菌多杀菌素产量

为解决多杀菌素（Spinosad）生产的基因工程难题，研究人员开展刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中 74-kb 多杀菌素基因簇（spn）过表达研究。结果显示工程菌株产量提升 124%，优化发酵培养基后达 920mg/L。该研究为多杀菌素生物合成优化提供依据。

　　在农业领域，多杀菌素（Spinosad）作为一种高效且环保的生物杀虫剂，备受关注。它由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵产生，属于聚酮类大环内酯化合物，对害虫具有良好的防治效果，同时对哺乳动物和有益昆虫毒性低，易降解，不会对环境造成长期污染。然而，目前多杀菌素的生产面临着诸多挑战。一方面，刺糖多孢菌 DNA 的高甲基化水平使得针对提高多杀菌素产量的基因工程操作困难重重；另一方面，其生物合成的调控机制尚不明确，这限制了通过基因工程手段提升产量的研究进展 。此前，虽有对多杀菌素生物合成基因簇部分基因的研究，但完整 74-kb 多杀菌素基因簇（spn）过表达的研究仍属空白，且在异源宿主中表达产量普遍较低。为突破这些困境，提升多杀菌素的产量，来自复旦大学和中国医药工业研究总院上海医药工业研究院的研究人员开展了相关研究。
研究人员通过一系列实验，成功构建了过表达完整 spn 基因簇的工程菌株刺糖多孢菌 - spn（Sa. spinosa - spn）。他们运用 CRISPR/Cas9 介导的转化相关重组（TAR）克隆技术，构建了质粒 pCM265 - spn，并将其导入刺糖多孢菌中。研究结果令人瞩目，与野生型菌株相比，工程菌株 Sa. spinosa - spn 的多杀菌素产量大幅提高了 124%，达到 693mg/L。这一成果表明，过表达完整的 spn 基因簇能显著促进多杀菌素的生物合成。
为深入探究过表达 spn 基因簇对刺糖多孢菌的影响，研究人员进行了多方面的分析。在形态学研究中，他们发现过表达 spn 基因簇不仅延缓了孢子形成，还改变了菌丝形态。通过对相关基因（bldD、ssgA、whiA、whiB 和 fstZ）转录水平的分析，揭示了这些形态变化的内在机制。bldD 基因转录上调，而 ssgA、whiA、whiB 和 fstZ 基因转录下调，这些变化导致孢子形成延迟，菌丝分隔减少 。在多杀菌素生物合成方面，转录分析显示 spn 基因簇中 19 个相关基因的转录水平均有不同程度的上调，表明次生代谢得到增强，这直接解释了多杀菌素产量增加的现象。此外，研究人员利用响应面法（RSM）对发酵培养基进行优化，确定了棉籽粕、葡萄糖和大豆油的最佳浓度，使多杀菌素产量进一步提升至 920mg/L。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是 CRISPR/Cas9 介导的 TAR 克隆技术，用于获取并克隆完整的 spn 基因簇；二是定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），用于分析目标基因的表达水平；三是高效液相色谱（HPLC）技术，用于测定多杀菌素的浓度；四是响应面法（RSM），用于优化发酵培养基。
本研究成功构建了过表达完整 spn 基因簇的工程菌株，揭示了过表达该基因簇对刺糖多孢菌生长、发育及多杀菌素生物合成的影响，并通过发酵优化显著提高了多杀菌素产量。这一研究成果为多杀菌素生物合成的进一步优化提供了重要的理论依据和实践指导，对推动生物杀虫剂的工业化生产具有重要意义。同时，研究中发现的过表达 spn 基因簇对刺糖多孢菌初级和次级代谢的影响，也为深入研究微生物代谢调控机制提供了新的视角，有助于后续在其他菌株中开展类似研究，进一步挖掘多杀菌素的生产潜力。