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为探究猪睾丸细胞异质性及基因表达动态，云南农业大学等机构研究人员运用长读长（Nanopore）和短读长（Illumina）scRNA-seq 技术研究保山猪睾丸。他们鉴定出多种细胞类型和关键信号通路，为理解猪精子发生分子机制提供重要依据。
在神秘的生命繁衍领域，精子的产生过程一直是科学家们深入探索的焦点。对于猪而言，其睾丸作为雄性生殖系统的核心器官，承担着精子生成和雄激素分泌的重任。然而，精子发生过程极为复杂，猪睾丸的细胞组成和调控机制一直未被充分了解。这就好比在黑暗中摸索，我们虽知道前方有重要的宝藏，但却看不清道路。保山猪作为我国云南省保山市特有的猪种，具有诸多优良特性，比如适应能力强、能高效利用粗饲料等，其肉质更是鲜嫩可口，富含多种营养物质。可美中不足的是，它的繁殖效率较低，这极大地限制了其在现代集约化养殖中的大规模推广。因此，深入研究保山猪精子发生的调控机制，对于保护这一珍贵的种质资源以及提高其繁殖效率具有至关重要的意义。
为了揭开保山猪精子发生的神秘面纱，来自云南农业大学、吕梁学院、云南开放大学以及保山猪研究所的研究人员携手合作，踏上了探索之旅。他们运用整合长读长（Nanopore）和短读长（Illumina）单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，对保山猪睾丸进行了全面深入的研究。最终，他们成功绘制出了保山猪睾丸细胞的转录全景图，为后续的研究提供了极为宝贵的资源。这一成果发表在《BMC Genomics》杂志上，引起了广泛关注。
研究人员在此次研究中主要运用了以下关键技术方法：首先，通过组织学分析，对猪睾丸组织进行处理和染色，观察其形态结构。接着，制备单细胞悬浮液，利用 10× Genomics 工作流程构建单细胞转录组文库。然后，分别进行 Illumina 短读长测序和 Nanopore 长读长测序，并对测序数据进行预处理。最后，运用多种生物信息学工具进行细胞聚类、注释、细胞通讯分析以及异构体检测和分类等。
下面来看看具体的研究结果：
- 睾丸组织形态学：通过对 18 月龄保山猪睾丸组织进行苏木精 - 伊红（H&E）染色分析，发现其生精小管结构完整，生精细胞按发育阶段有序排列，这表明 18 月龄保山猪已达到成年成熟阶段。
- 短读长单细胞转录组分析：研究人员运用 10× Genomics 工作流程对保山猪睾丸组织的细胞异质性进行分析。经过严格的质量控制，保留了 11520 个细胞的表达数据，鉴定出 23402 个基因。通过主成分分析（PCA）和均匀流形近似与投影（UMAP）等方法，成功识别出 9 个不同的细胞簇，并注释为 9 种关键细胞类型，包括支持细胞（Sertoli cells，SC）、巨噬细胞（Macrophages，M）、管周肌样细胞（Peritubular myoid cells，PTM）等。此外，还获得了 9 个关键标记基因在精子发生过程中的动态表达变化，并通过免疫荧光染色验证了部分标记基因的空间表达模式。同时，利用 Monocle2 软件确定了生殖细胞的 6 个发育阶段。
- 生殖细胞的基因本体分析：对 6 种不同生殖细胞类型的差异表达基因（DEGs）进行分析，发现不同阶段的生殖细胞基因参与了特定的生物学过程。例如，精原细胞（Spermatogonia，SPG）基因主要富集在细胞周期、染色体组织等过程；早期初级精母细胞（Early-stage primary spermatocytes，Early SPC）和晚期精母细胞（Late-stage spermatocytes，Late SPC）基因参与减数分裂细胞周期和雄配子产生；圆形精子细胞（Round spermatids，RS）和伸长 / 延长精子细胞（Elongating/elongated spermatids，ES）基因与精子发生、雄配子生成等相关；精子（Spermatozoa，Sperm）基因则主要与顶体组装和鞭毛精子运动有关。
- 睾丸细胞间的通讯：运用 CellChat 软件分析发现，不同细胞类型之间的相互作用在数量和强度上存在显著差异。研究人员鉴定出 8 条关键信号通路，包括巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）、神经调节蛋白（NRG）、无翅 / 整合（WNT）等。其中，巨噬细胞和圆形精子细胞是主要的信号接收者，精原细胞是细胞通讯的中心枢纽。而且，睾丸细胞间的相互作用主要遵循多对一的靶向模式，6 种生殖细胞类型之间存在强烈的细胞通讯。
- 长读长单细胞数据鉴定的异构体特征：利用 Nanopore 单细胞测序，鉴定出 19620 个非冗余异构体和 5787 个基因。这些异构体分为 5 种类型，其中新注释的异构体（NIC 和 NNC）约占 60%。FSM 异构体在转录本长度、编码序列长度、开放阅读框长度和外显子数量等方面均表现出优势。此外，还分析了不同细胞类型的异构体表达情况，发现长读长测序能够检测到更多低表达的异构体。
在研究结论和讨论部分，研究人员通过整合 Illumina 和 Oxford Nanopore 测序技术，对保山猪睾丸组织进行单细胞 RNA 测序，全面分析了细胞异质性、细胞间通讯以及基因表达和异构体的多样性。虽然研究中存在一些局限性，比如未能明确鉴定出 Leydig 细胞簇，支持细胞数量较少等，但这也为后续研究指明了方向。此次研究成果为深入理解猪精子发生的分子机制和雄性生殖生物学提供了新的视角，有助于推动猪繁殖技术的发展，为提高保山猪的繁殖效率提供理论依据，对保护和利用这一珍贵的种质资源具有重要意义。
