基于全转录组测序技术的临床癌症样本基因融合检测新方法开发与应用

《BMC Cancer》：Development and application of a whole transcriptome sequencing assay for the detection of gene fusions in clinical cancer specimens

为解决基因融合检测在临床癌症诊断中的技术瓶颈，上海肺科医院等团队开发了全转录组测序(WTS)检测方法。该研究通过优化RNA降解阈值(DV200≥30%)、输入量(>100 ng)和表达量(>40 copies/ng)等参数，在101例非小细胞肺癌(NSCLC)样本中检出68.9%可干预融合，整体灵敏度达98.4%。该技术为泛癌种基因融合的精准诊疗提供了新工具。

基因融合作为癌症的重要驱动因素，在非小细胞肺癌(NSCLC)中虽然发生率仅约5%，却能显著影响靶向治疗选择。然而传统检测方法如荧光原位杂交(FISH)和逆转录PCR(RT-PCR)存在通量低、无法发现新融合伴侣等局限。尽管RNA测序技术理论上能实现全转录组扫描，但临床应用中仍面临RNA降解、假阳性率高、检测标准缺失等挑战。

上海肺科医院联合多家机构的研究团队在《BMC Cancer》发表研究，开发了新型全转录组测序(WTS)检测体系。通过系统优化从样本处理到生物信息分析的22个关键参数，该技术成功检出包括MET外显子14跳跃(MET EX14 skipping)在内的多种融合变异，在101例NSCLC样本中发现20%携带可干预融合，为临床决策提供了分子层面的精准导航。

研究采用多中心队列设计，包含4个独立样本集：开发验证队列(63例)、回顾性队列(191例)、泛癌验证队列(156例)和临床实施队列(228例)。关键技术包括：基于NEBNext Ultra II的链特异性文库构建、Arriba融合检测算法优化、FoRNA软件检测外显子跳跃事件，以及RNA-SeQC质量控制系统。通过设置DV200≥30%、RNA输入>100 ng、融合表达>40 copies/ng等阈值，确保检测可靠性。

结果
WTS检测流程的准确性验证
在63例已知融合样本中检出62例，灵敏度达98.4%。特别值得注意的是，该技术成功识别出DNA测序易漏检的MET EX14 skipping事件。21例阴性对照均未出现假阳性，特异性达100%。

质量控制参数确立
研究发现DV200与比对率呈显著正相关(r=0.48)，优于传统RNA完整性指标(RIN)。当测序数据量>80 Mb时，融合检测灵敏度可达98.3%。

NSCLC中的可干预融合
在101例NSCLC样本中，检出29例(28.7%)携带融合，其中20例(19.8%)为可干预融合。ALK融合占比最高(9.8%)，包括典型EML4::ALK变异。

泛癌种融合图谱
分析228例融合阳性样本发现，除NSCLC外，ALK融合在子宫癌和软组织肉瘤中呈现独特伴侣基因。COL1A1::PDGFB融合被证实为皮肤纤维肉瘤的特异性标记物。

讨论与结论
该研究建立的WTS检测体系具有三大临床价值：

1. 技术层面：首次系统定义了临床级RNA测序的质量阈值，将DV200≥30%确立为FFPE样本合格标准；
2. 诊断层面：在保持100%特异性的同时，对低至40 copies/ng的融合转录本仍保持95%检出率；
3. 治疗层面：发现子宫肉瘤中ZC3H7B::BCOR融合与不良预后相关，拓展了融合基因的临床应用维度。

值得注意的是，研究也揭示了技术局限性：在1例EML4::ALK融合样本中出现假阴性，推测可能与转录本低表达或非功能性重排有关。未来可通过结合DNA测序进一步提高检出率。这项发表于《BMC Cancer》的成果，为推进精准肿瘤学提供了标准化、可推广的融合检测新范式。