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目前，间充质干细胞（MSCs）在再生医学中极具潜力，但现有质量设计指南未明确其生产框架。研究人员开展了确定和验证 MSCs 培养设计空间（DS）的研究。结果表明该方法可提升模型适用性和 DS 可靠性，对 MSC 培养工艺设计意义重大。
在再生医学的广阔领域中，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）宛如一颗璀璨的新星，为众多疾病的治疗带来了新的希望。它具有多种治疗功能，在细胞治疗领域前景光明。然而，随着对 MSCs 需求的不断攀升，确保其高质量生产成为了亟待解决的难题。一方面，MSCs 产品已获得监管批准，众多临床研究正如火如荼地开展，比如用于治疗创伤性脊髓损伤、移植物抗宿主病和神经系统疾病等。以克罗恩病为例，全球每年新增约
2.8×10例患者，成人单剂量通常需要
1.2×108个 MSCs，仅这一种疾病每年对 MSCs 的需求量就超过
3.0×1013个。但另一方面，MSCs 培养过程中的质量控制面临诸多挑战。细胞的表型和功能特性至关重要，细胞表型通过细胞表面生物标志物分析评估，细胞效力则需通过免疫调节、分化、旁分泌因子分泌以及自我更新等功能试验来证明 。同时，培养空间中细胞密度过高导致的汇合度问题，以及细胞老化现象，都会影响 MSCs 的质量。而且，细胞内在的异质性，如不同供体或起始细胞的生长动力学差异，使得建立高效可靠的培养条件变得困难重重。此外，传统的基于实验的设计空间（Design Space，DS）确定方法需要大量实验，成本高且耗时，难以满足 MSC 培养的需求。在此背景下，来自日本东京大学等机构的研究人员开展了一项旨在确定和验证 MSCs 培养设计空间的研究。该研究成果发表在《Communications Biology》上，为 MSCs 培养工艺的优化提供了重要依据，有望推动再生医学领域的进一步发展。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，进行细胞培养实验，使用来自同一批次的骨髓间充质干细胞，分别设置不同的接种密度和培养时间，由不同操作人员开展实验。其次，通过相衬显微镜自动采集图像，利用图像处理技术对细胞进行计数和分析。然后，运用数学模型，基于一组常微分方程（Ordinary Differential Equations，ODEs）来描述细胞生长过程，并对模型中的参数，如最大比生长速率（μm）进行估计和调整。
确定和验证设计空间的总体方法
研究人员先采用传统方法，结合先前的动力学模型和 Exp 1 数据确定 DS。但在使用 Exp 2 数据进行验证时，发现存在大量错误识别的情况。为解决这一问题，研究人员对传统方法进行改进。他们用部分 Exp 2 数据重新估计μm，计算其 95% 预测区间以生成生长预测的上下限，进而确定概率性 DS，再用剩余的 Exp 2 数据进行验证。整个过程执行时间约 10 分钟。
最大比生长速率的重新估计和模型验证
研究人员用 Exp 2A 的数据重新估计μm，通过最小二乘法优化得到μm的均值为2.76×10?2 h?1 ，样本标准差为1.46×10?3 h?1 ，归一化均方根误差（NRMSE）小于 10%，表明模型对预实验数据拟合良好。而且，使用重新估计的μm进行模型预测，与验证实验（Exp 2B 和 2C）的测量值之间的 NRMSE 也小于 10%，说明该模型可用于 DS 的确定。
最大比生长速率的预测区间和生长预测的限制
计算μm的双侧 95% 预测区间，得到上限μmUP=3.07×10?2h?1，下限μmLO=2.44×10?2h?1。将其代入模型预测，可视化预测的贴壁细胞数量限制与验证实验测量值。结果发现，生长预测的上下限反映了细胞生长随时间的可能变化，但在某些时间点与实际测量值存在偏差。同时，研究人员还考虑了其他变异来源，如接种异质性、粘附比和最大细胞密度等，通过随机采样模型参数进行模拟，发现不同接种密度在细胞粘附期和生长期对模拟限制的变异有不同影响，且 1000 次迭代后模拟结果收敛良好。
设计空间的确定和验证
基于μm预测区间的模拟限制，计算满足质量规范的概率，确定概率性 DS。结果显示，较低的接种密度需要较长的收获时间，较高的接种密度则在设计选择数量上更具优势。在对 DS 进行验证时，研究人员评估了 99 个实验条件，将其分为四种类型。结果表明，DS 中 12 个条件里有 11 个在验证实验中可行，R1值为 0.917，说明 DS 可作为可靠的 MSC 培养条件。此外，R2值较低，R3值较高，意味着虽有部分满足规范的条件未被识别，但大部分不可行条件被正确排除在 DS 之外，这对潜在的生产者、使用者和消费者有益。
预测区间对设计空间确定和验证的影响
研究人员对比了考虑和不考虑生长预测限制确定的 DS，发现不考虑预测区间的参考 DS 包含更多条件，但R1值较低，即错误识别为可行条件的情况更多。而新 DS 减少了错误识别的情况，提高了R3值，虽降低了R2值，但更能代表 MSC 培养可靠条件的保守估计，有利于 MSC 制造商选择合适的培养条件。
不同预实验和验证实验下设计空间的确定和验证
研究人员进一步将 DS 的确定和验证扩展到不同的预实验和验证实验组合，并设置不同的最小可接受风险（π）。结果发现，随着π增加，DS 覆盖面积缩小，部分组合甚至没有 DS。但无论π和预实验条件如何选择，这些 DS 中错误识别为可行条件的情况都较少，R1和R3值较高，R2值较低。这表明数据变异小的预实验更适合较高的π要求，为工业 MSC 培养工艺设计提供了参考。
研究通过建立基于模型的方法，结合实验和数值程序，成功确定并验证了 MSC 培养的概率性设计空间。该方法克服了实验变异性导致的模型性能不一致问题，通过重新估计μm提高了模型准确性和适用性，考虑预测区间有效纳入了细胞群体的生长变异，为 MSC 培养工艺设计提供了可靠条件。同时，研究还评估了样本量对模型预测能力的影响，为预实验设计提供了指导。不过，该研究也存在一定局限性，如仅考虑了部分可建模的质量指标，未来还需进一步探索更多质量指标，完善 MSC 培养工艺设计。总体而言，这项研究成果对 MSC 的研究、开发和制造具有重要意义，为再生医学中 MSCs 的应用奠定了更坚实的基础。
