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为解决传统原子力显微镜（AFM）研究生物膜存在的局限，研究人员开展了自动化大面积 AFM 分析生物膜组装的研究。结果揭示了生物膜形成早期的结构特征，明确了表面修饰对细菌黏附的影响。这有助于深入理解生物膜，推动相关领域发展。
在医疗、工业和环境领域，生物膜（由微生物细胞及其自身产生的胞外聚合物（EPS）组成的多细胞群落）发挥着重要作用。然而，人们对生物膜的形成机制、稳定性及其对环境压力的抗性等方面的理解并不完善。这主要是因为生物膜具有高度的异质性和动态性，其结构、组成、密度等在空间和时间上都存在变化，而且传统分析方法难以全面捕捉这些复杂特性，无法将微观细胞层面的变化与宏观功能结构的演变联系起来。
为了深入探究生物膜的奥秘，美国橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory）的研究人员展开了一项极具创新性的研究。他们开发了一种自动化大面积原子力显微镜（AFM）技术，旨在突破传统 AFM 的局限，更全面地分析生物膜的生长和结构。该研究成果发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是搭建自动化大面积 AFM 成像平台，通过定制的 Python 函数控制显微镜的样品台定位和成像参数，实现自动采集大区域图像；二是采用先进的图像拼接算法，如基于尺度不变特征变换（SIFT）的 Stitch2D 算法，确保高分辨率图像的无缝拼接；三是利用基于机器学习的图像分析方法，如基于 YOLOv8 模型的图像分割技术，对生物膜图像进行高效分析 。
高分辨率 AFM 成像研究 Pantoea sp. YR343
研究聚焦于从杨树根际分离的革兰氏阴性菌 Pantoea sp. YR343，它具有促进植物生长的特性。利用 AFM 对其在 PFOTS 处理的玻璃表面的附着和生长进行观察。在短暂培养（约 30 分钟）后，可观察到细胞长度约 2μm，直径约 1μm，还能清晰看到细胞周围高度约 20 - 50nm 的鞭毛结构。培养 6 - 8 小时后，细胞形成具有蜂窝状间隙的簇，AFM 高分辨率成像显示鞭毛在早期细胞附着和发育中起到重要作用，连接细胞间隙，增加附着面积。
自动化大面积 AFM 采集工作流程
研究人员搭建的自动化大面积 AFM 系统，通过图形用户界面（GUI）设置参数，自动采集多个网格图像，采集后对图像进行扁平化处理和拼接，生成无缝镶嵌图像，为后续分析做准备。在图像拼接算法选择上，对比多种算法后发现，Stitch2D 算法（使用 SIFT 作为特征检测器）能有效减少扫描漂移和重叠伪影，准确拼接图像，为生物膜结构分析提供可靠基础。利用 YOLOv8 模型对 AFM 图像进行分割，可自动提取细菌细胞的物理特征，如面积、偏心率、长轴、短轴和方向等，实现对微生物群落结构的自动化、全面分析。
大面积 AFM 成像研究 Pantoea sp. YR343 在 PFOTS 处理表面的生物膜
对在 PFOTS 处理表面生长 6 - 8 小时的 Pantoea sp. YR343 生物膜进行大面积 AFM 成像，扫描区域达0.3×0.15 mm2 。图像显示其具有蜂窝状结构，细胞排列呈现特定方向，约 - 45° 和 45° ，这种排列有利于生物膜结构稳定和细胞间相互作用。通过分析细胞高度、偏心率、面积等参数，发现细胞偏心率呈正态分布，平均为 0.8 ± 0.1，平均面积为0.96±0.4μm2 ，部分大细胞可能处于分裂过程。对鞭毛的研究发现，其跨越蜂窝状结构间隙，存在约 10 - 20nm 的纤维，这些纤维可组合形成更大结构，增强生物膜稳定性和连接性。研究还发现鞭毛覆盖面积与区域总面积呈幂律关系，指数接近 0.9，表明鞭毛不仅来自周边细菌，还来自内部细胞和脱离细胞，对生物膜扩展有重要作用。
优化结构化表面用于抗污和生物膜控制
研究人员采用具有不同间距的硅脊梯度结构表面，研究其对细菌黏附的影响。对在该表面生长 6 - 8 小时的 Pantoea sp. YR343 细胞进行分析，结果显示，较大脊间距时，蜂窝状结构受影响较小，但边缘效应明显；脊间距减小到约 10μm 时，蜂窝状结构被破坏，细胞沿脊排列。通过分析细胞方向，发现细菌倾向于平行于平台线排列。研究还发现，平台宽度约 5μm 时，细菌密度保持稳定，超过该宽度，细菌密度急剧下降，这为优化抗污表面设计提供了关键信息。
研究结论表明，自动化大面积 AFM 技术成功揭示了生物膜形成早期的详细细胞和亚细胞特征，以及整体群落结构。发现 Pantoea sp. YR343 在疏水表面形成蜂窝状形态，鞭毛在增强生物膜稳定性和传播方面发挥重要作用。同时，研究了表面形态对细菌附着的影响，为设计抗菌表面提供了有价值的参考。在未来，研究人员计划进一步拓展该平台，研究液体环境中的活细胞，获取纳米机械性能等功能信息，并通过稀疏采样和自适应成像路径等技术加速数据采集、降低成本。这一研究成果为生物膜研究开辟了新途径，有望推动临床、工业等领域生物膜管理策略的发展，助力解决生物膜相关的感染、设备污染等实际问题。
