磷酸结合口袋调控周期蛋白B依赖的CDK底物磷酸化与有丝分裂时序

为解决细胞周期中多底物磷酸化调控机制不明确的问题，研究人员聚焦周期蛋白B(cyclin B)的磷酸结合口袋(PP)，通过酵母模型揭示其对CDK1底物多位点磷酸化的促进作用。研究发现PP突变导致芽殖酵母有丝分裂进程延迟、APC/C复合体亚基磷酸化异常，证实PP与Cks1协同调控底物磷酸化模式，为理解细胞周期时序精准性提供了新机制。

　　

细胞周期进程的精准调控是生命活动的核心问题之一，而周期蛋白依赖性激酶(CDK)与周期蛋白(cyclin)的复合物在其中扮演着关键角色。尽管已知CDK能磷酸化数百种底物，但多位点磷酸化的时空控制机制仍存在大量未解之谜。特别是在有丝分裂阶段，CDK1与B型周期蛋白(如cyclin B)如何通过协同作用确保底物磷酸化的顺序性和完整性，直接影响着染色体分离、纺锤体组装等关键事件的时序。这项研究揭示了周期蛋白B上一个鲜为人知的磷酸结合口袋(phosphate-binding pocket, PP)的重要功能，为理解细胞周期调控网络增添了关键拼图。

美国加州大学旧金山分校的Henry Y. Ng、David O. Morgan团队在《Nature Communications》发表研究，通过构建芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的CLB2基因PP位点突变体(clb2-pp)，结合活细胞成像、蛋白质磷酸化分析和质谱技术，系统阐明了PP对CDK1底物多位点磷酸化的调控作用及其对有丝分裂时序的影响。研究发现PP突变会导致APC/C复合体亚基Cdc16/Cdc27磷酸化缺陷，延迟后期启动，同时影响极性体(polarisome)组分Bud6/Spa2的磷酸化模式，最终破坏细胞形态和分裂时序。

关键技术包括：1) 酵母遗传学方法构建CLB2-PP突变体及CLB1/CLB3缺失株；2) 同步化培养结合Western blot分析周期蛋白降解动力学；3) 体外激酶实验评估重组Clb2-Cdk1-Cks1复合物对APC/C亚基的磷酸化效率；4) Phos-tag SDS-PAGE分离多位点磷酸化产物；5) 定量质谱鉴定底物特异性磷酸化位点。

结果解读

磷酸结合口袋是细胞正常增殖所必需的

通过比较野生型与clb2-pp突变体酵母的生长曲线发现，单独PP突变在30℃下不影响增殖，但与CLB1/CLB3缺失组合时会导致40%生长速率下降。显微镜观察显示clb1△clb2-pp clb3△三重突变体出现显著的芽体伸长和链状排列现象，表明PP在维持正常细胞形态中具有不可替代的作用。

调控有丝分裂进入后期的时序

利用mCherry标记的纺锤体极体(SPB)示踪发现，clb2-pp细胞从纺锤体初始分离到完全延展的时间中位数延长至48分钟（野生型32分钟）。Western blot显示后期启动标志物securin/Pds1的降解延迟，且在clb1△clb2-pp clb3△突变体中延迟超过120分钟。通过构建swe1△和mad2△突变体证实，这种延迟与形态发生检查点或纺锤体组装检查点(SAC)无关，而是直接源于APC/C磷酸化异常。

促进APC/C亚基的体外磷酸化

免疫沉淀酵母APC/C复合体进行体外激酶实验，发现PP突变显著降低Cdc16、Cdc27和Apc9亚基的磷酸化速率。对重组Cdc27片段(241-360aa)的分析显示，PP突变主要影响Ser267等位点的二次磷酸化。质谱数据进一步揭示PP对非共识磷酸化位点（如Bud6-Thr76）的选择性调控。

调控极性体亚基的磷酸化

针对芽体形态缺陷，研究发现极性体组分Bud6(126-360aa)和Spa2(524-670aa)的多位点磷酸化强烈依赖PP功能。Phos-tag电泳显示PP突变导致Spa2磷酸化模式简化，暗示PP通过调控细胞极性网络影响形态建成。

结论与意义

该研究首次阐明周期蛋白B的磷酸结合口袋与Cks1协同工作的分子机制：PP通过识别初始磷酸化位点（"引物磷酸化"），促进CDK1对邻近次级位点的后续修饰。这种级联磷酸化模式精确控制APC/C活化、极性体功能等关键过程，从而保障有丝分裂事件的时序性。发现不仅解释了酵母中CLB2突变体的表型，也为人类cyclin B1同源位点（R307/H320/K324）的功能研究提供范式。由于CDK-cyclin-Cks调控网络的异常与癌症发生密切相关，PP的发现为靶向细胞周期药物的开发提供了新思路。