基于结构设计强效且选择性靶向 RIPK3 的抑制剂：消除体外靶向毒性的新策略

RIPK3 在坏死性凋亡中至关重要，抑制它是潜在治疗策略。但 RIPK3 抑制剂开发受阻，存在靶向凋亡和激酶选择性有限问题。研究人员设计 LK 系列抑制剂，有效抑制 RIPK3 且避免靶向凋亡，为设计安全选择性抑制剂提供新策略。

　　在生命的微观世界里，细胞的死亡方式多种多样，其中坏死性凋亡（necroptosis）就像一把双刃剑，与众多疾病的发生发展紧密相连。它参与了神经退行性疾病、缺血再灌注损伤、炎症性疾病以及癌症等多种病症的进程。在坏死性凋亡的信号通路中，受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 3（RIPK3）扮演着核心角色，它就像是这条通路的 “指挥官”，掌控着细胞走向坏死性凋亡的命运。因此，抑制 RIPK3 成为了极具前景的治疗策略，有望为相关疾病的治疗开辟新的道路。

然而，科研人员在开发 RIPK3 抑制剂的征程中却遭遇了重重困难。一方面，现有的 RIPK3 抑制剂存在靶向毒性问题，在抑制坏死性凋亡的同时，会引发 RIPK3 介导的细胞凋亡（apoptosis），就像在战斗中误伤到了自己人，严重影响了抑制剂的安全性和临床应用潜力。例如，知名的 RIPK3 抑制剂 GSK'872，在浓度约为其半数有效浓度（EC₅₀）两倍时，就会触发细胞凋亡，导致细胞死亡。另一方面，这些抑制剂对 RIPK3 的激酶选择性也不够高，容易 “误伤” 其他激酶，干扰正常的细胞生理功能。

面对这些困境，中国科学院上海药物研究所等机构的研究人员决心攻克难题，开展了一项旨在设计强效且选择性靶向 RIPK3 抑制剂的研究，希望能消除体外靶向毒性，为相关疾病的治疗带来新的希望。

研究人员首先聚焦于 R69H 突变，这个突变就像是一把神奇的钥匙，能够防止 RIPK3 抑制剂诱导的靶向凋亡。通过深入研究，他们发现 R69H 突变通过破坏 RIPK3 二聚化来发挥作用。基于这一发现，研究人员以 GSK'872 为基础，进行结构改造，设计并合成了一系列 LK 系列抑制剂。

在后续的实验中，研究人员对这些抑制剂进行了全面的评估。生化分析显示，LK 系列抑制剂能够有效抑制 RIPK3 的激酶活性，其中代表性化合物 LK01003 对 RIPK3 激酶活性的抑制常数（IC₅₀）低至 2 nM，展现出强大的抑制能力。细胞实验表明，LK01003 等化合物在小鼠 L929 和人 HT29 细胞中，能够有效阻断肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）诱导的坏死性凋亡，且不会诱导细胞凋亡，成功解决了靶向毒性的难题。此外，LK01003 还表现出极高的激酶选择性，在针对 379 种激酶的筛选中，它对 RIPK3 的选择性显著优于 GSK'872，为开发高选择性的 RIPK3 抑制剂提供了有力的证据。

通过 X 射线晶体学分析，研究人员揭示了 LK 系列抑制剂的作用机制。LK01003 属于一种独特的 I_1/2型抑制剂，它能够结合到 RIPK3 的一个新的疏水位点，诱导 RIPK3 关键结构域，如 αC 螺旋和 DFG 基序（Asp-Phe-Gly 基序）发生构象变化，使 RIPK3 稳定在非活性构象，从而有效抑制其活性，同时避免了靶向凋亡的发生。

为了进一步验证占据新发现疏水位点策略的有效性，研究人员基于其他具有显著靶向凋亡的抑制剂，设计并合成了新的化合物，如 LK01004 和 LK01033。实验结果令人振奋，这些新化合物不仅能够有效抑制 RIPK3，阻断坏死性凋亡，还成功避免了靶向凋亡的发生，进一步证明了该策略的可行性和普适性。

这项研究成果发表在《Nature Communications》上，具有重要的意义。它为 RIPK3 抑制剂的理性设计提供了全新的策略和可靶向位点，为开发更安全、更有效的 RIPK3 抑制剂奠定了坚实的基础，有望推动相关疾病治疗药物的研发进程，为众多患者带来新的希望。

研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。在蛋白质研究方面，通过重组蛋白表达和纯化技术获取所需的蛋白，利用蛋白质结晶和结构测定技术解析蛋白与抑制剂的复合物晶体结构，从而揭示抑制剂的作用机制。在细胞实验方面，采用细胞活力测定、坏死性凋亡诱导和抑制测定等实验，评估抑制剂对细胞的影响。此外，还运用了 ADP-Glo 激酶测定法来检测激酶活性，通过色谱分析研究蛋白与抑制剂的相互作用。

下面来详细介绍研究结果：

• R69H 突变对细胞凋亡及蛋白结构的影响：研究发现，R69H 突变可使细胞免受 GSK'872 诱导的凋亡。通过共晶体结构分析和尺寸排阻色谱实验表明，R69H 突变通过破坏激酶结构域二聚体界面的氢键相互作用，促进 mRIPK3^KD二聚体解聚为单体。
• 模拟 R69H 突变的抑制剂设计与评估：基于 GSK'872 的结构，研究人员设计合成了 LK01001、LK01002 和 LK01003 等化合物。这些化合物对 RIPK3 激酶活性抑制效果显著，且在 L929 和 HT29 细胞中能有效阻断 TNF-α 诱导的坏死性凋亡。其中，LK01002 和 LK01003 效果更为突出，且不会引发靶向毒性。
• LK01003 的选择性及作用机制：LK01003 对 RIPK3 具有高度选择性，与 mRIPK3^KD结合时，其独特的结合模式使 αC 螺旋和 DFG 基序发生构象变化，形成新的疏水结合位点，稳定 RIPK3 的非活性构象，有效阻止激酶结构域二聚化，避免靶向凋亡。
• 抑制剂构象变化与靶向毒性的关系：对比多种 RIPK3 抑制剂发现，I 型抑制剂使 mRIPK3 稳定在活性构象，易诱导凋亡；II 型抑制剂和 LK 系列（I_1/2型）抑制剂使 mRIPK3 稳定在非活性构象，可避免凋亡。且抑制剂破坏二聚化并非防止靶向凋亡的必要条件。
• 占据新位点策略的验证：基于 PP2 和 Zhar-99 设计的新化合物 LK01004、LK01005 和 LK01033，能有效抑制 RIPK3，阻断坏死性凋亡且不诱导靶向凋亡，同时提高了激酶选择性，证明占据新位点策略可消除靶向凋亡并降低脱靶效应。

研究结论表明，研究人员成功设计并合成了一系列新型 RIPK3 抑制剂，如 LK01003 和 LK01045 等，这些抑制剂不仅能有效抑制 RIPK3 的 ATP 酶活性和坏死性凋亡，还避免了靶向凋亡的发生。同时，研究揭示了 RIPK3 抑制剂诱导的构象变化与靶向毒性之间的关系，明确了非活性构象在消除靶向凋亡中的关键作用。此外，通过多个实例证明，靶向 RIPK3^KD中新发现的位点，不仅能消除靶向凋亡，还能提高激酶选择性。这项研究为设计更安全、更具选择性的 RIPK3 抑制剂提供了重要的理论依据和策略，具有广阔的应用前景。但目前研究主要基于分子和细胞实验，未来还需在动物模型中进一步评估这些 I_1/2型抑制剂的药代动力学性质和治疗潜力，以推动其向临床应用的转化。