丘脑室旁核双通路介导内脏痛与焦虑行为的机制探秘

这篇研究发现，产前母体应激（PMS）子代小鼠会出现内脏超敏和焦虑样行为。丘脑室旁核（PVT）的不同亚区，即前室旁核（aPVT）和后室旁核（pPVT），分别通过不同分子靶点和神经通路调控内脏痛和焦虑，为相关疾病治疗提供新方向。

　　

研究背景

慢性内脏痛（CVP）在肠易激综合征（IBS）患者中较为常见，全球患病率较高，且常与焦虑共病，二者相互影响形成恶性循环。然而，由于缺乏合适的动物模型，对其潜在的分子和神经回路机制研究进展缓慢。早期生活应激是导致内脏超敏和情绪障碍的关键因素，其中产前母体应激（PMS）会增加后代患焦虑症的风险，但相关基础研究较少。

丘脑室旁核（PVT）在疼痛和情绪调节中起重要作用，它可与杏仁核、前额叶皮层（PFC）等疼痛相关网络直接相连，参与疼痛信息的传递和处理。同时，PVT 也参与应激、焦虑和情绪反应等信息的处理，并与其他神经回路相互作用。但传统观点忽视了 PVT 的解剖、功能和神经化学异质性，实际上，PVT 可分为前 PVT（aPVT）和后 PVT（pPVT）等不同亚区，这些亚区在神经元结构、类型和连接性上存在差异，可能在生理和病理过程中发挥不同作用。

杏仁核是大脑边缘系统的关键结构，可被疼痛等有害刺激激活，在调节焦虑、抑郁等负面情绪中起核心作用。杏仁核主要包含基底外侧杏仁核（BLA）和中央杏仁核（CeA），BLA 接收内外部信息并传递给 CeA，CeA 对这些信息进行评估和整合，进而指导行为和生理反应。不过，BLA 和 CeA 在疼痛和情绪调节中的具体功能仍存在争议。

实验方法

1. 动物模型建立：将 8 - 10 周龄的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠随机配对交配，怀孕雌性小鼠随机分为对照组（CON）和 PMS 组。PMS 组小鼠在妊娠第 7 天开始接受间歇性应激，包括水回避应激（WAS）、冷束缚应激（CRS）和强迫游泳应激（FSS），子代小鼠饲养至 6 周龄用于后续实验。
2. 行为学测试
   • 内脏痛测试：通过结直肠扩张（CRD）阈值和腹部肌电图（EMG）记录评估小鼠的内脏痛。在 CRD 测试中，将带球囊的导管插入小鼠结直肠，逐渐充气直至小鼠出现腹部收缩反应，记录此时的压力作为 CVP 阈值；EMG 测试则通过植入腹部肌肉和颈部的电极，记录 CRD 刺激时的肌电信号，计算信号曲线下面积（AUC）来评估内脏痛程度。
   • 躯体痛测试：采用 von Frey 纤维刺激小鼠后爪评估机械性撤爪反应，以及使用热板测试评估小鼠对热痛的敏感性。
   • 焦虑行为测试：利用高架平台应激（EP）诱导小鼠产生焦虑样行为，通过开放场测试（OFT）和高架十字迷宫测试（EPM）评估小鼠的焦虑程度。在 OFT 中，记录小鼠在中央区域的停留时间；在 EPM 中，记录小鼠在开放臂的停留时间。
   • 抑郁行为测试：通过悬尾测试（TST）和强迫游泳测试（FST）评估小鼠的抑郁样行为，记录小鼠的不动时间。
   • 运动功能测试：使用转棒测试（RRT）评估小鼠的运动功能，记录小鼠在转棒上的停留时间。
   
   
3. 免疫荧光染色：实验结束后，对小鼠进行心脏灌注固定，取脑并进行冰冻切片，然后进行免疫荧光染色。使用的抗体包括抗 c - Fos、抗谷氨酸、抗 GABA、抗 CACNA1E、抗 GRIN2A、抗 VGluT2 和抗 NeuN 等，通过激光共聚焦显微镜观察荧光信号，分析目标分子的分布和定位。
4. 立体定位显微注射和光纤植入：在麻醉小鼠后，将其固定在立体定位仪上，根据脑图谱确定目标脑区的坐标，进行病毒注射或光纤植入。例如，aPVT、pPVT、BLA 和 CeA 的坐标分别为（ML: 0 mm, A - P: -0.35 mm, DV: -3.8 mm）、（ML: 0 mm, A - P: -2.0 mm, DV: -3.15 mm）、（ML: 3.2 mm, A - P: -1.15 mm, DV: -5.0 mm）和（ML: 2.6 mm, A - P: -1.05 mm, DV: -4.95 mm）。
5. 光遗传学操作：在目标脑区植入光纤，连接激光发生器，通过控制激光的频率、强度和波长等参数，对特定神经元进行光刺激，观察小鼠的行为变化和神经元活动。
6. 光纤光度测定系统：向目标脑区注射含有特定神经元启动子的钙指示剂，植入光纤，记录清醒小鼠在 CRD 和 EP 刺激下神经元的钙活动，数据通过 MATLAB 软件进行分析。
7. 病毒相关实验
   • 结直肠 - 脑病毒追踪：将 HSV - 1 病毒注射到小鼠结直肠壁，用于观察与结直肠有解剖连接的脑区。
   • 顺行跨突触追踪：采用 Cre - DIO 病毒策略，观察 aPVT 与 BLA、pPVT 与 CeA 之间的投射。
   • 基因敲低实验：设计针对 Cacna1e 和 Grin2a 的短发夹 RNA（shRNA），构建 AAV2/9 - VGluT2 - Cacan1e - EGFP shRNA、AAV2/9 - VGluT2 - Grin2a - EGFP shRNA 和 AAV2/9 - EGFP - scramble shRNA 病毒，用于特异性敲低相应基因的表达。
   • Tet - off 系统相关实验：利用 Tet - off 病毒系统结合 c - Fos 染色，实现对 PVT 神经元的功能依赖性标记和追踪。
   
   
8. RNA 测序和分析：收集 CON 和 PMS 小鼠的 aPVT 和 pPVT 脑区样本，提取 RNA 进行测序。通过生物信息学分析，筛选出差异表达基因（DEGs），并对其进行功能分析，确定与疼痛和情绪相关的关键基因。

实验结果

1. PVT 参与成年 PMS 子代小鼠的内脏痛和焦虑调节：PMS 子代雄性和雌性小鼠均表现出明显的内脏痛和焦虑样行为，且未出现运动、躯体痛和抑郁样行为。CRD 刺激和 EP 应激后，PVT 中 c - Fos 表达显著增加，且 PMS 小鼠的变化更为明显。此外，在 PVT 中观察到 HSV 标记的神经元与 c - Fos 的共定位，表明 PVT 在结构和功能上参与了结肠内脏痛的调节。
2. aPVT^Glu和 pPVT^Glu分别调节内脏痛和焦虑：利用 Tet - off 病毒系统结合 c - Fos 染色发现，内脏痛激活的神经元主要位于 aPVT，焦虑激活的神经元主要位于 pPVT，且二者无重叠。CRD 刺激可增加 aPVT^Glu的钙活动，而 EP 应激对其无影响；相反，EP 应激可增加 pPVT^Glu的钙活动，CRD 刺激对其无影响。光遗传学抑制 aPVT^Glu可减轻 PMS 小鼠的内脏痛，抑制 pPVT^Glu可缓解小鼠的焦虑。
3. aPVT 中 Cacna1e 上调调节内脏痛，pPVT 中 Grin2a 上调介导焦虑样行为：RNA 测序分析发现，aPVT 中 Cacna1e 表达上调，pPVT 中 Grin2a 表达上调。免疫荧光染色证实了这两种基因在相应脑区的特异性表达变化。特异性敲低 aPVT^Glu中的 Cacna1e 可降低 CRD 刺激时的钙活动，提高内脏痛阈值；敲低 pPVT^Glu中的 Grin2a 可减少 EP 应激时的钙活动，增加小鼠在 OFT 和 EPM 中的焦虑相关指标改善情况。
4. aPVT^Glu和 pPVT^Glu分别依赖投射到 BLA^Glu和 CeA^GABA发挥功能：通过功能依赖性病毒追踪技术发现，aPVT^Glu激活后主要投射到 BLA^Glu，pPVT^Glu激活后主要投射到 CeA^GABA。电生理学结合光遗传学实验验证了 aPVT^Glu - BLA^Glu和 pPVT^Glu - CeA^GABA电路的功能连接性。
5. aPVT^Glu - BLA^Glu和 pPVT^Glu - CeA^GABA神经回路分别调节内脏痛和焦虑：抑制 aPVT - BLA 电路可降低 BLA^Glu的钙信号，减轻小鼠的内脏痛；抑制 pPVT - CeA 电路可降低 CeA^GABA的钙信号，缓解小鼠的焦虑。光遗传学和化学遗传学实验进一步证实了这两个神经回路在调节内脏痛和焦虑中的作用。
6. aPVT^Glu - BLA^Glu内脏痛信号通过激活 CeA^GABA促进焦虑，而 pPVT^Glu - CeA^GABA焦虑信号不影响内脏痛：抑制 aPVT^Glu可增加小鼠在 OFT 和 EPM 中的焦虑相关指标改善情况，而 pPVT 对 CRD 刺激无反应且不调节内脏痛。通过病毒追踪策略发现，aPVT - BLA 电路可直接投射到 CeA，形成 aPVT - BLA - CeA 电路，该电路可能通过调节 CeA^GABA来调节焦虑。同时抑制 aPVT - BLA - CeA 和 pPVT - CeA 两条通路，可更显著地减轻 PMS 小鼠的焦虑样行为。

研究结论

本研究利用新建立的小鼠模型，揭示了 PVT 在调节内脏痛和焦虑中的功能异质性。aPVT 主要调节内脏痛，pPVT 主要调节焦虑，它们通过不同的下游投射通路和分子机制发挥作用。aPVT^Glu激活后投射到 BLA^Glu，形成调节内脏痛的 aPVT^Glu - BLA^Glu电路，且该电路可通过调节 CeA^GABA加重焦虑；pPVT^Glu激活后投射到 CeA^GABA，形成调节焦虑的 pPVT^Glu - CeA^GABA电路，该电路不影响内脏痛。这些发现为深入理解慢性内脏痛和焦虑共病的神经机制提供了新视角，为临床个性化治疗和靶向药物开发奠定了理论基础。