揭秘潮间带甲壳动物生物钟：大脑中的日潮节律基因密码

本文通过对潮间带甲壳动物（Eurydice pulchra 和 Parhyale hawaiensis）大脑中生物钟基因表达的研究，发现了约 60 个推定的时钟细胞，其基因表达可追踪日潮时间，这为揭示潮汐生物钟机制及相关神经网络提供了关键线索，极具研究价值。

　　

研究背景

生物体通过内部生物钟驱动的代谢、生理和行为节律来适应周期性环境。陆地环境周期以日为主，生物进化出约 24 小时周期的生物钟（circadian clock）；沿海环境更复杂，海洋生物还进化出潮汐（约 12.4 小时）、半月（约 14.8 天）和月运（约 29.5 天）等计时机制。然而，潮汐生物钟的机制尚不清楚，目前有三种主要假说：一是潮汐和昼夜节律由单一可塑性振荡系统驱动；二是由成对的内在周期约 24.8 小时的生物钟反相运行产生潮汐节律；三是存在独立的 12.4 小时和 24 小时振荡器分别驱动潮汐和昼夜表型。

动物的昼夜生物钟围绕转录 / 翻译反馈环（TTFL）运行，正调控因子 CLOCK（CLK）和 BMAL1（或果蝇中的 CYC）通过 E-box 启动子位点激活编码负调控因子 PERIOD（PER）、CRYPTOCHROME2（CRY2）和 / 或 TIMELESS（TIM）的基因，负调控因子积累后抑制激活，降解后循环重启。潮间带的 Eurydice pulchra 和 Parhyale hawaiensis 能表现出自发的昼夜和 / 或潮汐运动行为节律，但目前仅知道 E. pulchra 的潮汐计时分子标记与线粒体基因表达和细胞氧化还原状态有关。这两种动物都含有编码 CLK、BMAL1、PER 和 CRY2 的基因，且 Bmal1 基因的缺失会影响它们的潮汐活动节律，暗示昼夜和潮汐生物钟在分子遗传水平可能存在相互作用。本研究旨在描述 Bmal1、Clk、per 和 cry2 等基因在大脑中的表达，识别推定的 “时钟” 细胞，并探究它们与昼夜和潮汐行为的关系。

研究方法

1. 实验动物采集与饲养：E. pulchra 于英国安格尔西岛 Llanddona 海滩春季涨潮时用手拖网采集成年个体；P. hawaiensis 的 Chicago F 品系在实验室中用特定条件饲养，包括适宜的温度、光照周期、海水盐度、食物供应和定期换水等。
2. 行为分析：通过特定的活动监测设备和软件记录 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的游泳或运动行为。对 E. pulchra，在黑暗条件下记录其游泳行为，分析其潮汐游泳活动的节律性；对 P. hawaiensis，监测其在不同条件下的运动活动，通过不同的统计方法判断其是否具有节律性以及节律的周期和强度。
3. 大脑样本处理：实验动物经麻醉后，在冰浴的生理盐水中解剖大脑，随后固定、脱水并储存。用于免疫组织化学（immunohistochemistry）和原位杂交实验时，需先将大脑样本复水、洗涤和平衡。
4. 免疫组织化学：用抗 SYNORF1 抗体标记神经毡，不同动物的处理步骤略有差异。E. pulchra 需进行通透处理，与抗体孵育后再与二抗孵育，最后用 DAPI 染色；P. hawaiensis 则是先与抗体在特定缓冲液中孵育，洗涤后与二抗孵育，再用 DAPI 染色，最后进行样品制片。
5. 参考大脑构建：对免疫标记的大脑样本进行成像，通过特定软件对多个大脑图像进行配准和平均，构建 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的参考大脑，用于后续分析。
6. 杂交链式反应荧光原位杂交（HCR-FISH）：设计并合成针对特定基因的 HCR 探针，按照优化后的实验步骤进行操作，包括样本通透、预杂交、探针杂交、信号放大、DAPI 染色和样本制片等，用于检测基因表达。
7. RNAscope 方法：对 E. pulchra 的大脑进行特定处理，制作石蜡切片，按照 RNAscope 试剂盒的说明进行操作，包括脱蜡、抗原修复、蛋白酶处理、杂交、信号放大和染色等步骤，用于检测基因表达。
8. 时间进程采样设计：根据不同的研究目的，对 E. pulchra 和 P. hawaiensis 在特定条件下进行饲养和观察，选取具有特定行为节律的个体，在不同时间点采集大脑样本进行后续实验。
9. 全脑数字 HCR-FISH 及数据分析：对处理后的大脑样本进行成像，通过特定软件和算法对图像进行处理和分析，包括细胞分割、斑点检测和统计分析等，以量化基因表达水平和判断其节律性。

研究结果

1. 大脑中生物钟基因的表达：在 E. pulchra 和 P. hawaiensis 的大脑中，Bmal1 表达广泛且在光暗（LD）周期中强度不变；Clk 在 E. pulchra 大脑中表达广泛，部分细胞信号较强，在 P. hawaiensis 大脑中则在中脑区域细胞有富集。per、cry2 和 tim 在 E. pulchra 大脑的中脑离散细胞簇中有强烈特异性信号，P. hawaiensis 大脑中 per 和 cry2 的表达模式与之相似。
2. 推定时钟细胞的确定：在 E. pulchra 大脑中，Clk 富集的细胞表达 Bmal1、per、cry2 和 tim，这些细胞共表达了功能性 TTFL 所需的基因，被认为是推定的时钟细胞。P. hawaiensis 大脑中，Clk 富集的细胞也表达 Bmal1 和高浓度的 cry2，且 cry2 富集的细胞也表达 per，同样被认定为推定的时钟细胞。通过将 HCR-FISH 与抗 SYNORF1 免疫荧光结合，确定了这些细胞在大脑中的分布，E. pulchra 有 8 个细胞群，P. hawaiensis 有 9 个细胞群，每侧半球约有 30 个细胞，分布对称。
3. E. pulchra 大脑中时钟基因的节律性表达：野外采集的 E. pulchra 在实验室自由运行条件下表现出强烈的潮汐活动节律。对其大脑进行 HCR-FISH 实验发现，在 LD（16L:8D）条件下，per、cry2 和 tim 的总脑表达显示出强烈的每日节律，峰值出现在黑暗后期；tim 的总表达还显示出 12 小时的节律。在个体细胞群水平，5 个细胞群中一个或多个转录本有显著节律，如中后细胞的 per 和 cry2 表达呈每日模式，峰值在深夜；内侧细胞的 per 呈每日节律，tim 呈 12 小时节律；后外侧细胞的 tim 有 12 小时周期。这表明不同细胞群在 E. pulchra 中似乎能够追踪每日或潮汐时间。
4. P. hawaiensis 大脑中时钟基因的昼夜和潮汐表达：实验室饲养的 P. hawaiensis 经潮汐模拟训练后，在自由运行条件下表现出潮汐活动节律，且其潮汐生物钟对机械刺激敏感。对这些动物大脑进行 HCR-FISH 实验发现，在潮汐训练且表现出潮汐活动的动物中，per 的总表达呈昼夜节律，cry2 总表达无时间变化。在个体细胞群中，中后细胞和前内侧 a1 细胞的 per 和 cry2 表达呈昼夜节律，且二者反相；背外侧细胞的 per 和 cry2 表达呈 12 小时周期，且二者几乎同相，峰值出现在主观高潮后。多次实验表明，这些细胞的表达模式具有稳定性，且背外侧细胞能独立于昼夜时间追踪潮汐时间。
5. P. hawaiensis 在 LD 周期下时钟基因表达的变化：当 P. hawaiensis 在 LD 周期下无潮汐刺激时，表现出夜间活动的节律性。对其大脑的 HCR-FISH 分析显示，per 和 cry2 的总表达呈节律性，多个细胞群包括中后细胞和前内侧 a1 细胞的 per 和 cry2 表达呈每日模式且反相，但背外侧细胞的 per 和 cry2 表达无统计学显著节律。这表明背外侧细胞的潮汐基因表达是特定于潮汐条件的，在无潮汐刺激时不表现出潮汐模式，也不跟随其他细胞的每日节律。

研究讨论

研究在 E. pulchra 和 P. hawaiensis 大脑中鉴定出约 60 个共表达多种时钟基因的细胞，这些细胞分布在不同的离散细胞群中。Bmal1 虽对维持潮汐行为至关重要，但其在大脑中的广泛表达未显示出特定的细胞富集，而 Clk、per 和 cry2（以及 E. pulchra 中的 tim）在特定细胞群中的富集表明它们可能作为昼夜振荡器发挥作用。

在 E. pulchra 中，不同细胞群的时钟基因表达模式不同。在潮汐活动的个体中，per 和 cry2 的总表达呈每日节律，反映了它们的昼夜作用；tim 的总表达不仅有 24 小时的昼夜模式，还有 12 小时的节律，这在特定细胞群如内侧和后外侧细胞中体现为 12 小时的积累，表明这些细胞可能参与潮汐计时。在 P. hawaiensis 中，per 的表达在不同条件下表现出昼夜或潮汐节律，不同细胞群的 per 和 cry2 表达相位关系不同，提示不同物种的昼夜 TTFL 分子结构可能存在差异。背外侧细胞在潮汐训练后表现出稳定的潮汐基因表达模式，是专门的潮汐振荡器的有力候选者，但目前还不清楚其独特的分子机制，以及不同细胞群的时钟基因表达与潮汐行为之间的确切关系。

此外，研究发现尽管大多数细胞表现出约 24 小时的振荡，只有少数细胞表现出约 12 小时的振荡，但动物整体却表现出强烈的潮汐行为。这可能是因为潮汐刺激的多样性和复杂性，导致部分潮汐细胞群在现有实验条件下未被检测到，或者不同潮汐细胞群对不同的潮汐刺激有反应。未来研究可通过改变潮汐刺激方式，如潮汐浸泡 / 暴露实验，进一步探究潮汐细胞的功能和机制。

综合研究结果，该研究数据支持存在专门的潮汐和昼夜定时器的模型，即不同细胞群中的经典昼夜基因可调节为潮汐或昼夜周期。这一发现为研究潮汐和昼夜生物钟的输入和输出通路提供了细胞层面的基础，有助于进一步明确昼夜和潮汐神经时钟的本质和连接性，为深入理解生物的时间调控机制提供了重要线索 。