揭示维甲酸：YAP1 信号轴调控心房谱系定向分化的关键机制

本文聚焦心脏发育研究，发现维甲酸（RA）信号通路与 Yes 相关蛋白 1（YAP1）相互作用，调控心脏祖细胞（CPCs）向心房谱系分化。研究借助多种实验技术，证实 YAP1 对心房腔形成及相关基因表达的重要作用，为心脏发育机制研究和相关疾病治疗提供新方向。

　　

研究背景

维生素 A 经代谢转化为维甲酸（RA），在早期发育中，RA 信号通路对心脏祖细胞（CPCs）的分化起着关键作用，它能调控位于第二心脏场（SHF）的 CPCs 的前后模式形成，促进后 SHF 向心房和静脉窦谱系分化，同时限制前 SHF（AHF）向特定区域发育 。在 CPCs 分化过程中，RA 精确调控靶基因表达至关重要，其表达失衡会干扰心脏结构和心房发育。已有研究表明，RA 可诱导转录因子（如 HOXA1 和 NR2F2）表达，同时抑制 HAND1 和 MEF2C 等转录因子，其中 NR2F2 对赋予细胞心房身份十分关键，其突变会导致先天性心脏病。

YAP1 及其同源物 TAZ 是 Hippo 通路的转录效应因子，在发育过程中参与调节细胞增殖和生长。虽然 YAP1 在心肌细胞（CM）增殖中的作用已被证实，但它在 CPCs 细胞命运决定以及哺乳动物心脏分化和结构形成中的作用仍不明确。本研究旨在探究 YAP1 在心脏发育中的具体作用机制。

研究方法

1. 细胞培养与分化：利用人胚胎干细胞（hESCs）进行体外实验，将其分化为心室 CMs 或在添加 RA 的条件下分化为心房样 CMs。实验使用了 H1 和 H9 两种 hESCs 细胞系，通过特定的分化方案，在不同时间点添加不同的信号通路调节剂，如 ChIR、IWP - 2 等，以诱导细胞向特定方向分化。
2. 基因编辑：构建 YAP1 基因敲除（KO）的 hESCs 细胞系，通过 Sanger 测序和蛋白质免疫印迹（WB）分析进行验证，用于研究 YAP1 缺失对细胞分化和基因表达的影响。
3. 单细胞测序技术：运用单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）和单核 ATAC 测序（snATAC - seq）技术，分别对未处理和 RA 处理的 hCPCs 以及小鼠胚胎进行分析，以探究基因表达变化和染色质可及性改变，从而揭示细胞群体的异质性和潜在的调控机制。
4. 染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）和 ChIP - qPCR：用于检测 YAP1、TEAD4 等蛋白与特定 DNA 区域的结合情况，分析 RA 处理对这些蛋白结合的影响，进而确定它们在基因调控中的作用。
5. 小鼠模型：使用 Yap1^Flox/Flox:Sox^cre和 Mesp1^cre/+基因编辑小鼠模型，通过条件性敲除 Yap1 基因，在体内研究 YAP1 对心脏发育的影响。对不同发育阶段的小鼠胚胎进行分析，包括 E7.75 和 E8.25 等时间点。
6. 蛋白质 - DNA 复合物建模：运用 AlphaFold3 对蛋白质 - DNA 复合物进行建模，预测 TEAD4、NR2F2、GATA3 和 YAP1 等转录因子与 DNA 的结合模式和相互作用，为实验结果提供结构生物学方面的支持。

研究结果

1. RA 诱导 hCPCs 转录组变化：在 hESCs 向心肌细胞分化过程中，添加 RA 可使 hCPCs 向心房样 CM 命运转变。通过 scRNA - seq 分析发现，RA 处理的 hCPCs 与未处理的相比，有 159 个差异表达基因（DEGs）。未处理的 hCPCs 表达典型的心室前体基因，而 RA 处理后，这些标记基因下调，同时后 SHF 基因表达增加。在分化 30 天时，RA 处理的细胞主要分化为心房样 CMs，未处理的则主要分化为心室样 CMs，这表明实验成功诱导出不同类型的心肌细胞。
2. RA 信号诱导 TEAD4 - 含增强子的开放：snATAC - seq 分析显示，RA 处理显著改变了 hCPCs 的染色质可及性，共发现 11,800 个差异激活区域（DARs）和 7,456 个失去 DNA 可及性的区域。对这些区域进行 DNA 基序分析发现，RA 处理后，一些抑制性因子（如 TGIF1）的结合基序可及性降低，而与心脏发育相关的转录因子（如 GATA3、HOXA1、MEIS1/2、FOXP1/2 和 NR2F2）的结合基序可及性增加。其中，4,111 个 RA - 开放位点含有 TEAD4 识别基序，且这些位点大多位于基因转录起始位点（TSS）远端，与增强子相关。GO 分析表明，这些 RA 诱导的 TEAD4 DARs 附近的基因主要参与心脏腔室发育和 CM 分化。ChIP - seq 分析进一步证实了 TEAD4 蛋白在这些增强子区域的存在。
3. YAP1 结合 RA - 谱系增强子含 TEAD4：ChIP - seq 分析显示，RA 处理导致 YAP1 与含有 TEAD4 结合基序的 RA 诱导 DARs 的结合显著增加。约 10% 的 YAP1 峰值与 RA 诱导的 DARs 相关，且与含有 TEAD4 基序的 DARs 密切相关。ChIP - qPCR 分析也验证了这一结果，表明 YAP1 在这些区域的结合受 RA 调控。此外，RA 诱导的 TEAD4 增强子常含有其他关键转录因子（如 GATA3 和 NR2F2）的结合基序，AlphaFold3 分子建模进一步证明了这些转录因子可同时结合到染色质上。
4. YAP1 调节 RA - 谱系增强子含 TEAD4：对 RA 处理的 YAP1 KO hCPCs 进行 snATAC - seq 分析，发现 7,066 个 DNA 区域失去可及性，其中 1,722 个来自 RA 诱导的染色质区域，且 75% 含有 TEAD4 基序激活区域。这表明 YAP1 对 RA 诱导的关键增强子的开放至关重要，其缺失会影响这些增强子的功能。
5. YAP1 调节 hCPCs 中的 RA 靶基因：scRNA - seq 分析表明，YAP1 缺失影响了 RA 处理的 hCPCs 中 74 个基因的表达水平，包括典型的 NR2F2 抑制基因（如 APOA1 和 APOA2）、其他心脏发育相关的 RA 靶基因（如 KDR、CHCHD10、GYPB 和 HAS2）以及特定的心房基因（如 MYL7、ACTC1 和 NPPB）。同时，心室谱系基因（如 HAND1 和 MEF2C）在 YAP1 KO hCPCs 中上调。GO 分析进一步支持了 YAP1 靶基因在 CPC 分化和心脏发育中的重要作用。
6. YAP1 影响 RA 处理的 CPCs 向心房样 CMs 分化：在 RA 处理的 YAP1 KO hCPCs 向心房样 CMs 分化过程中，虽然细胞存活和增殖不受明显影响，但 scRNA - seq 分析显示，与 WT 相比，YAP1 KO aCMs 中多个关键发育基因的表达发生差异，包括 HES1、ACTA1 等。同时，YAP1 KO aCMs 中典型的心室 CM 基因表达升高，而心房标记基因表达降低，这表明 YAP1 缺失干扰了心房 CM 的转录组和分化程序。
7. YAP1 调节人模式化心脏器官 oid 中心房腔的发育：利用 hESC - 来源的心脏器官 oid 模型研究发现，YAP1 KO 器官 oid 虽能从第 0 天发育到第 30 天，但比 WT 更小且更细长。在器官 oid 发育过程中，与 WT 相比，YAP1 KO 器官 oid 中心房标记基因（如 NR2F2、GJA5 和 NPPA）的表达显著降低，而心室标记基因（如 MYL2、MYL3 和 MYH7）的表达升高。通过免疫荧光分析发现，YAP1 KO 器官 oid 中心房腔的大小明显减小，而心室腔大小相似。此外，用 YAP1 抑制剂处理 WT 器官 oid 可模拟 YAP1 KO 的效果，进一步证实 YAP1 在心房腔发育中的重要作用。
8. YAP1 调节心脏器官 oid 中 PE 的发育：在心脏发育过程中，CPCs 在 RA 信号作用下会分化形成前心外膜器官（PE），释放信号参与心脏模式形成。研究发现，YAP1 KO 器官 oid 的 PE 发育不良，其 WT - 1 和 ALDH1A2 蛋白染色区域显著减少，这与 YAP1 缺失导致的 RA 信号活性受损有关，也与先前在小鼠模型中关于 YAP1/TAZ 在心外膜发育中作用的研究结果一致。
9. YAP1 在小鼠胚胎中的作用：通过使用 Yap1^Flox/Flox:Sox^cre系统在小鼠胚胎的外胚层中条件性敲除 Yap1，进行 scRNA - seq 分析发现，Yap1 缺失加速了外胚层向原始条纹衍生谱系的分化，对早期造血轨迹影响最大。在心脏领域，Yap1 缺失导致心脏场中差异表达基因数量增加，特别是在 SHF 中，许多与心脏结构形成和 SHF 模式相关的基因表达发生改变，如 Nr2f2 下调，Gata6、Mef2c 和 Irx5 等上调。RT - qPCR 和 WB 分析验证了这些基因表达的变化趋势。此外，Yap1 cKO 胚胎在 E9 左右死亡，在 E8.25 时可观察到 NR2F2 和 NPPA 蛋白水平降低。
10. YAP1 调节胚胎中 RA 信号通路的活性：对 Yap1 cKO 与对照胚胎进行单细胞通路富集分析（SCPA）发现，Yap1 缺失后，维生素 A/RA 通路基因在心血管轨迹（包括心脏中胚层、FHF 和 SHF）以及神经外胚层和体节中胚层的簇中显著富集。同时，RA 靶基因 Hotairm1 在多个簇中下调，而典型的 RAR 共抑制因子 Hdac1 和 Ncoa2 上调。此外，参与维生素 A/RA 代谢的基因（如 Rbp1、Cyp26a1 和 Aldh1a2）表达也发生改变，表明 Yap1 缺失可能降低了早期胚胎中 RA 的生物利用度，影响了 RA 信号通路的稳态。

讨论

本研究揭示了 Hippo 效应因子 YAP1 在 CPCs 中对关键 RA 靶基因的调节作用。RA 处理可促使 YAP1 与 NR2F2 和 GATA3 等转录因子一起招募到心脏增强子上，YAP1 缺失则会阻碍 RA 诱导的增强子开放和谱系基因表达。在 hESC 来源的心脏器官 oid 中，YAP1 对心房腔和 PE 器官的形成至关重要，而对心室发育并非必需。体内分析也支持 YAP1 在调节早期胚胎中维生素 A/RA 活性和 SHF 前后模式相关基因表达中的作用。

先前研究虽发现含有 TEAD 基序的增强子在 CPCs 的 pSHF 中显著富集，但未对其功能进行实验验证。本研究表明，RA 信号通过招募 YAP1 激活了 TEAD 增强子，为理解心脏发育的调控机制提供了新的视角。然而，关于这些增强子上转录因子的层级关系尚未明确，如 NR2F2 或 GATA3 是否招募 YAP1，或者 YAP1 是否引导这些因子打开增强子，仍有待进一步研究。

此外，以往小鼠研究中使用的 Nkx2.5 - cre 驱动的 Yap1 敲除模型存在局限性，其在 E7.5 才开始发挥作用，且主要在心室谱系的 CPCs 中活跃，无法很好地研究 YAP1 在 CPCs 中的作用。本研究使用 Sox2 - cre 和 Mesp1 - cre 驱动的模型，虽在一定程度上揭示了 YAP1 的作用，但也存在不足，如无法精确确定 YAP1 在早期心脏特化过程中的作用，未来需要开发更合适的模型来深入研究。

维生素 A 稳态对心脏发育至关重要，YAP1 对 RA 靶基因的调节影响了维生素 A 稳态相关基因的表达。研究 YAP1 在心脏结构缺陷患者（如 DiGeorge 综合征患者）中对维生素 A 失调的作用具有重要意义，可能为相关疾病的治疗提供新的靶点和思路。

总体而言，本研究确定了维生素 A/RA 和 YAP1 信号通路在心脏发育中的重要作用，揭示了 YAP1 在心脏腔室模式形成中的作用，有望为器官 oid 工程提供新的策略，通过调节 YAP1 活性来精确控制心脏腔室的发育。