重塑缩醛磷脂可调节巨噬细胞对细胞毒性氧化甾醇的反应及动脉粥样硬化斑块易损性

本文聚焦于髓系细胞中必需脂肪酸代谢在免疫功能的作用。研究发现，同时失活巨噬细胞多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢关键酶 LPCAT3 和 ELOVL5，会破坏膜结构，增加巨噬细胞对细胞毒性氧化甾醇敏感性，影响动脉粥样硬化斑块稳定性，为相关疾病研究提供新方向。

　　

引言

巨噬细胞在心血管代谢疾病，如动脉粥样硬化、肥胖、2 型糖尿病和代谢相关脂肪性肝炎（MASH）的发病过程中起着核心作用。它们能根据病原体、凋亡细胞、脂蛋白和细胞因子等多种微环境刺激，灵活调整自身的激活状态。

必需脂肪酸（FAs）对巨噬细胞功能的调节作用备受关注。哺乳动物细胞无法自行合成 n - 3 或 n - 6 位带有双键的 FAs，巨噬细胞只能依赖于整体的代谢或饮食环境，以及局部的脂质环境来摄取这些必需脂肪酸。而且，不饱和脂肪酸是巨噬细胞产生的生物活性分子（如前列腺素、白三烯和特异性促分解介质）的前体。

作为甘油磷脂的组成部分，多不饱和脂肪酸（PUFAs）在膜生物物理学中具有关键作用，能够调节膜的流动性、曲率、微结构域的形成，以及膜对过氧化反应的敏感性。虽然饮食中补充必需脂肪酸会直接影响巨噬细胞的脂肪酸组成，但髓系细胞对这些脂肪酸的代谢能力也不容忽视，它们可以通过激活、去饱和和延长反应，将这些脂肪酸导向分解代谢途径或合成次级脂肪酸。目前，人们对调节 PUFAs 进入磷脂（PLs）或其他脂质分子（如胆固醇酯，CEs）的调控途径了解甚少。

研究团队及其他研究小组对溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3（LPCAT3）产生了兴趣。LPCAT3 属于溶血磷脂酰基转移酶（LPLAT）家族，参与 Lands 循环，可促进酰基辅酶 A（AcylCoA）转移到溶血磷脂的 sn - 2 位置，进而合成二酰基甘油磷脂。在巨噬细胞中，LPCAT3 是花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA）代谢的关键决定因素，Lpcat3^?/?巨噬细胞的二酰基磷脂中 AA 和 EPA 含量显著降低。有趣的是，AA 在 PLs 中掺入缺陷的同时，其延长产物肾上腺酸（ADA，C22:4 n - 6）在 PLs、CEs 和游离脂肪酸中大量积累。这可能是巨噬细胞维持细胞 PUFA 稳态的一种补偿机制。考虑到维持 PUFA 稳态的重要性，研究人员推测这一过程可能涉及冗余途径，包括脂肪酸延长途径。因此，单一的 “打击” 策略可能不足以引起膜 PUFA 稳态的重大改变。基于此，研究人员筛选参与脂肪酸延长的酶，探究同时靶向相关途径是否会显著改变巨噬细胞的 PUFA 含量，以及是否会影响动脉粥样硬化的发展。

结果

1. Lpcat3 和 Elovl5 在调节巨噬细胞 PLs 中 PUFA 含量的互补作用：研究证实，与对照细胞相比，源自 E14 小鼠胚胎肝脏的 Lpcat3^?/?巨噬细胞中，缩醛磷脂内的 AA 和 EPA 显著减少，同时 C22 PUFAs（如 C22:4 n - 6 和 C22:5 n - 3）相对含量代偿性增加，使得 PLs 中的 PUFA 含量总体保持类似水平。在磷脂酰乙醇胺（PEs）和磷脂酰胆碱（PCs）中也观察到类似变化。这表明在 Lpcat3 缺陷细胞中，C20 PUFAs 可被一种延长酶高效转化为 C22 PUFAs，并通过 LPCAT3 非依赖机制掺入 PLs。

在骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中，ELOVL 家族的 ELOVL2 和 ELOVL5 是 PUFA 合成的主要延长酶，但 ELOVL2 的 mRNA 水平几乎检测不到，ELOVL5 的表达相对较高。通过 CRISPR - Cas9 技术构建的 Elovl5^?/? RAW 264.7 细胞，其血浆酰乙醇胺中 C20:4/C22:4 n - 6 和 C20:5/C22:5 n - 3 的比值显著增加，且在 PEs 和 PCs 中 C22 PUFAs 也减少。由此可见，ELOVL5 是巨噬细胞中负责将 C20 PUFAs 延长为 C22 PUFAs 的关键酶，可补偿 Lpcat3 的缺陷。

1. Lpcat3/Elovl5 缺陷改变巨噬细胞 PLs 的 PUFA 含量：研究人员通过将髓系细胞中 Lpcat3 缺陷的小鼠（Lpcat3^Komac小鼠）与 Elovl5 缺陷的小鼠（Elovl5^?/?）杂交，建立了 Lpcat3/Elovl5 双缺陷小鼠模型。实验验证了基因敲低效率，Lpcat3^Komac和 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/? BMDMs 中 Lpcat3 mRNA 水平降低约 80%，Elovl5^?/?和 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中 Elovl5 表达也有相同程度的下降。

对这些细胞中的二酰基甘油磷脂（包括 PEs、PCs 和缩醛磷脂）进行全面的脂质组学分析，主成分分析（PCA）显示不同基因型在头两个维度上呈现明显聚类。Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞与 Lpcat3^Komac巨噬细胞类似，含有 AA 或 EPA 的二酰基甘油磷脂和缩醛磷脂减少；同时，Elovl5^?/?和 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中含 C22 PUFAs 的 PLs 也减少。在 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中，C20 PUFAs 减少的同时，PLs 中含 C22 PUFAs 并未出现代偿性增加。此外，这些巨噬细胞以及 Elovl5^Ko巨噬细胞中，含有饱和或单不饱和脂肪酸（MUFAs）且碳链较短的 PL 物种增多，且 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中这种变化更为明显。这一变化与脂肪酸去饱和酶（如硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1，Scd1 和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 2，Scd2）的诱导有关。总体而言，Lpcat3/Elovl5 双敲除的主要后果是含 PUFAs 的 PL 物种（缩醛磷脂、PC 和 PE）百分比下降。

1. Lpcat3/Elovl5 缺陷导致质膜内胆固醇富集微区增加：先前研究表明，PLs 中 PUFA 含量的改变会影响细胞膜特性和微区形成，这是因为胆固醇和鞘脂对饱和脂肪酸和 MUFAs 的亲和力高于 PUFAs。研究人员利用与 GFP 荧光染料融合的产气荚膜梭菌溶素 O 的 D4 片段，对质膜内胆固醇富集微区进行定量分析。结果显示，与其他基因型相比，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞的荧光强度增加，这表明质膜内胆固醇发生重新分布，胆固醇富集微区增多。

研究人员进一步从 BMDMs 中分离出耐去污剂膜（DRMs），对其结构和脂质组成进行研究。结果发现，耐去污剂组分（轻组分）对应于含有最高胆固醇水平的 3 和 4 号组分。与其他基因型相比，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞 DRMs 中的胆固醇水平显著增加，而在重组分中胆固醇水平未发生变化。对主要的 PCs、PEs 和血浆酰 - PE（pPE）物种在轻重组分中的分析表明，轻组分富含含有饱和脂肪酸或 MUFA 链的脂质，如 32:0 PC。Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞与其他三种基因型相比，在轻重组分中含有 MUFAs 的 PC、PE 和 pPE 增加，PUFA 含量降低。PCA 分析显示，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞根据 PC2 维度与其他基因型不同，含有 MUFAs 的 PC 和 pPE 是主要的贡献因素。

1. 骨髓中 Lpcat3/Elovl5 联合缺陷促进 Ldlr^?/?受体小鼠坏死核心形成：研究人员探究了巨噬细胞中由 Lpcat3/Elovl5 联合缺陷引发的 PUFA 稳态改变，是否会影响高胆固醇血症小鼠模型的动脉粥样硬化进程。他们对受体 Ldlr^?/?小鼠进行致死性照射，然后移植来自 Lpcat3^+/+/Elovl5^+/+、Lpcat3^Komac、Elovl5^?/?和 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?骨髓的造血细胞。恢复四周后，小鼠喂食西式饮食十二周，随后进行安乐死并评估动脉粥样硬化病变。

实验结果显示，四组小鼠在血液学参数和外周血单核细胞亚群计数方面没有显著差异。血浆脂质分析表明，各组在总胆固醇或高密度脂蛋白胆固醇水平上无差异，但 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?组的血浆甘油三酯水平降低。

对动脉粥样硬化病变的分析发现，与单基因敲除相比，移植 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?造血细胞的雌性 Ldlr^?/?受体小鼠主动脉根部的病变大小显著增加，坏死区域也明显增多。TUNEL 染色显示，移植 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?造血细胞的 Ldlr^?/?小鼠中凋亡细胞积累增加。在雄性受体 Ldlr^?/?小鼠中也观察到类似现象，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?组的病变面积和坏死面积均有显著增加。

通过对公开的单细胞 RNA 测序（RNA - seq）数据集分析发现，Lpcat3 和 Elovl5 在斑块内 Trem2⁺泡沫巨噬细胞中共表达。对小鼠主动脉斑块的 CEs 分析显示，移植 Lpcat3^Komac造血细胞的 Ldlr^?/?小鼠中，AA 和 ADA 在 CEs 中的含量显著增加，在接受 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?造血细胞的小鼠中更为明显。这表明 PUFAs 从 pPE 重新分布到 CEs。PCA 分析显示，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞根据主成分 1（PC1）和主成分 2（PC2）维度与其他基因型不同，含有 MUFAs 的 PC 和含有 20:4 FAs 的 PEs 是主要贡献因素。

1. Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞对 7 - KC 的敏感性增加，可通过缩醛磷脂递送挽救：为深入探究潜在机制，特别是验证动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞死亡率更高的假设，研究人员在体外评估了巨噬细胞对动脉粥样硬化斑块中大量存在的细胞毒性氧化甾醇 7 - 酮胆固醇（7 - KC）的敏感性。由于氧化甾醇（尤其是 7 - KC）的细胞毒性与它们在胆固醇富集微区的积累有关，研究人员推测不同基因型中 DRM 组成的变化可能影响巨噬细胞对细胞毒性氧化甾醇的易感性。

实验结果表明，与其他基因型相比，Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?小鼠的巨噬细胞对 7 - KC 处理更为敏感，尤其是在 80 μM 浓度下。靶向 PL 分析显示，7 - KC 处理导致含有 AA 的缩醛磷脂选择性消耗，而这些脂质正是受 LPCAT3 - ELOVL5 轴调节最为明显的物种。通过 GFP - D4 探针或原子力显微镜对 DRMs 的分析表明，7 - KC 处理对 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞的影响更为显著，经 7 - KC 处理的 BMDMs 中这些微区几乎完全消失。

为评估含有 AA 的缩醛磷脂是否能直接对 7 - KC 起到保护作用，研究人员在 7 - KC 处理前，将巨噬细胞与富含 p18:0/20:4 pPE 的脂质体或对照脂质体（18:0 PC）孵育 24 小时。结果显示，与富含缩醛磷脂的脂质体孵育可限制 7 - KC 对 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中胆固醇富集微区标记的影响。虽然在 Lpcat3^+/+/Elovl5^+/+巨噬细胞中，富含缩醛磷脂的脂质体可能由于 AA - 缩醛磷脂过载而诱导细胞毒性，但在 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞中，它几乎完全消除了 7 - KC 诱导的细胞死亡。

此外，研究人员用 LXR 激动剂 GW3965 处理 BMDMs 进行挽救实验。已知 LPCAT3 和 ELOVL5 是 LXR 的靶点，LXR 依赖的途径（ABCG1）可保护巨噬细胞免受氧化甾醇毒性。结果显示，GW3965 处理显著增加了巨噬细胞中 LXR 靶点（如 Abca1、Abcg1 和 Lpcat3）的水平，并对 7 - KC 诱导的细胞死亡提供了显著保护。有趣的是，虽然 Lpcat3^Komac/Elovl5^?/?巨噬细胞有受到保护的趋势，但 LXR 激动剂预处理在预防这些细胞中 7 - KC 诱导的死亡方面效果较差。

1. 通过单细胞 RNA - seq 和孟德尔随机化探索 LPCAT3 和 ELOVL5 在人类斑块中的表达及潜在作用：为更直接地评估研究结果在人类中的相关性，研究人员分析了已发表的人类颈动脉斑块单细胞 RNA - seq 数据，并对髓系群体进行了深度亚聚类。结果发现，ELOVL5 在大多数巨噬细胞群体中组成性表达，而 LPCAT3 主要在泡沫巨噬细胞（包括非炎症性巨噬细胞 TREM2^hi和新描述的促炎症性泡沫巨噬细胞 TREM1^hi/PLIN2^hi）中富集。

通过比较 LPCAT3⁺和 LPCAT3^?斑块巨噬细胞的表达谱，发现 LPCAT3⁺巨噬细胞中富集的顶级基因主要参与脂质代谢、吞噬作用和炎症反应，这表明这些巨噬细胞能很好地适应脂质积累或炎症刺激的环境，如在动脉粥样硬化中。LXR 靶基因（SMPDL3A、ABCA1、SCD 和 LXRα）的显著富集，以及清道夫受体（CD36 和 MARCO）和参与胆固醇处理（ABCA1、LIPA、NCEH1 和 CYP27A1）和脂肪酸代谢（SCD、FABP5 和 Lp - PLA2）的基因的存在，进一步支持了 LPCAT3 是斑块内巨噬细胞 LXR 反应的重要组成部分，有助于它们适应富含脂质的微环境这一观点。

研究人员还进行了孟德尔随机化分析，以探索 LPCAT3 和 ELOVL5 表达水平与人类缺血性中风发生率之间的潜在因果关系。从 eQTLGen 数据库中提取与这些基因相关的顺式表达数量性状位点（cis - eQTLs）作为暴露因素，利用 CHARGE 联盟的全基因组关联研究（GWAS）结果作为结局。分析结果显示，人类全血中 LPCAT3 表达对缺血性中风风险有显著的负向因果效应，即较高的 LPCAT3 表达与较低的缺血性中风可能性相关。

1. 人类颈动脉粥样硬化斑块中氧化甾醇、缩醛磷脂含量与斑块易损性的关系：研究人员利用团队近期开展的糖尿病患者颈动脉狭窄斑块中花生四烯酸代谢（MASCADI）研究