重大发现！急性肝损伤中两类再生细胞群体的奥秘与肝病治疗新曙光

本文通过对乙酰氨基酚（APAP）处理的小鼠进行单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析及组织学评估，发现急性肝损伤再生过程中有两类增殖细胞群体。一类由坏死组织接触诱导、增殖能力强且有去分化特征；另一类增殖时保留成熟肝细胞功能。这为肝再生及肝衰竭治疗策略提供新见解。

　　

研究背景

肝脏疾病每年导致超 200 万人死亡，占全球死亡率的 4%，而肝移植是目前治疗肝衰竭的唯一根治方法。肝脏虽有强大的再生能力，但再生机制尚未完全明晰。此前关于肝再生的研究多采用部分肝切除术模型，无法完全代表临床常见的伴有炎症和坏死的急性肝损伤。同时，肝脏再生细胞的起源也存在争议，多种潜在的肝干细胞或祖细胞，如来自赫令管的细胞、EpCAM?和 Lgr5?细胞等，其对急性肝损伤再生的实际贡献尚不明确。近期研究虽表明成熟肝细胞可能是再生细胞的主要来源，但具体的分子机制仍不清楚。因此，深入探究肝脏再生机制对开发减少肝移植依赖的治疗策略至关重要。

实验方法

1. 动物模型：选用 8 周龄雄性 C57B/6J 小鼠，禁食过夜后腹腔注射 APAP（300mg/kg）诱导肝损伤。在坏死组织注射实验中，将供体小鼠肝脏组织处理后，经皮注射到受体小鼠肝脏，48 小时后处死小鼠。所有实验操作均遵循相关动物实验伦理规范。
2. 人类样本：收集九州大学医院急性肝炎患者的肝脏组织样本，这些患者的组织学检查显示存在坏死性肝损伤。该研究遵循赫尔辛基宣言，并获得了九州大学医院伦理委员会的批准。
3. 组织学分析：对组织切片进行抗原修复、封闭处理，然后与一抗孵育过夜，再进行二抗染色，最后使用荧光显微镜采集图像。
4. scRNA - seq 分析：获取 APAP 处理小鼠和部分肝切除小鼠的 scRNA - seq 数据，使用 R 软件中的 Seurat 包进行分析。对数据进行标准化、整合，去除 doublets 和低质量细胞，进行聚类分析、细胞周期分析等，并计算信号得分和进行基因本体富集分析。

实验结果

1. 肝再生中特定细胞群体的高增殖能力：分析 APAP 处理小鼠的 scRNA - seq 数据，对肝细胞数据聚类得到 14 个簇。细胞周期分析显示，48 小时时 S 和 G2 - M 期细胞比例最高，增殖标记基因 Mki67、Pcna 和 Tyms 表达增加。其中，簇 7 的 Mki67 阳性细胞比例最高，且与核苷酸和谷氨酸合成相关的基因上调，表明其为最具增殖能力的群体。
2. 再生过程中出现两个增殖簇：簇 7 由 mRNA 剪接相关基因（Malat1 和 Neat1）和 Trp53inp1 的上调所定义。通过对干细胞相关基因表达和信号通路分析，发现簇 7 具有去分化特征，其干细胞相关基因表达较高，ErbB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等相关信号通路被激活。同时，簇 0/1/8 也存在增殖现象，该簇细胞表达较高水平的 Alb 和 Trf，提示其可能是代谢活跃的群体，但与簇 7 相比，其增殖相关代谢途径未显著上调。综合判断，APAP 诱导的肝再生过程中出现了两个增殖群体：簇 7（具有去分化和高增殖特征）和簇 0/1/8（高度分化的肝细胞增殖群体）。
3. 高增殖和去分化的细胞群体是面对坏死的细胞：对 APAP 处理后的小鼠进行组织学评估，发现 48 小时时在坏死区域边界出现具有独特形态的肝细胞，命名为 “界面坏死区域瞬时再生细胞”（INTR 细胞）。通过免疫组化染色，确定簇 7 细胞与 INTR 细胞特征相符，而非 INTR 细胞对应簇 0/1/8。进一步研究发现，INTR 细胞中 Hedgehog、MAPK、JAK - STAT 和肿瘤坏死因子（TNF）等信号通路被激活，且表达 ANXA2 和 ZEB1，提示可能发生上皮 - 间质转化（EMT）。在其他药物（如烯丙醇，AA）诱导的肝损伤中，也观察到 INTR 细胞出现在坏死区域边界。
4. INTR 和非 INTR 细胞的细胞周期进展速率不同：通过免疫荧光和免疫组化染色对细胞周期相关蛋白进行检测，发现 INTR 和非 INTR 细胞的 Ki67 阳性细胞出现时间和比例不同，INTR 细胞在 48 - 72 小时 Ki67 阳性细胞增多，而非 INTR 细胞在 48 小时后才出现 Ki67 阳性细胞且比例较低。对细胞周期蛋白 Cyclin D1（G1/S 期）和 Cyclin B1（M 期）的检测结果显示，INTR 细胞在 48 小时后 Cyclin D1 和 Cyclin B1 表达较强，而非 INTR 细胞 Cyclin D1 表达较弱且无 Cyclin B1 表达，表明两者在 G1/S 到 M 期的进展存在差异。通过测量双核细胞比例和分析 DAPI 强度及核面积，发现 INTR 细胞在 72 小时内可能经历了两轮细胞分裂，而非 INTR 细胞在 72 小时时才进入 S 期且 DNA 复制持续进行，说明 INTR 细胞群体的增殖能力更强。
5. 抑制 EGFR、c - Jun 和 mTOR 对 INTR 细胞增殖有显著影响：分别使用 EGFR 抑制剂（卡奈替尼二盐酸盐）、JNK（c - Jun N 端激酶）抑制剂（SP600125）和 mTOR 抑制剂（雷帕霉素）处理小鼠，观察对细胞增殖的影响。结果表明，抑制 EGFR 和 c - Jun 可显著降低 INTR 细胞的增殖标记物（Ki67 和 Cyclin D1）阳性率，对非 INTR 细胞影响较小；抑制 mTOR 可降低 INTR 和非 INTR 细胞的 Ki67 阳性率，且在非 INTR 细胞中可诱导 c - Jun 表达，使其 DNA 复制加快，说明这些信号通路对 INTR 和非 INTR 细胞的增殖均有影响，但细胞的响应存在差异。
6. 与坏死组织接触是转化为 INTR 细胞的必要条件：EGFR、JNK 和 mTOR 抑制并未影响 INTR 细胞在组织学染色中的出现。通过将坏死肝脏组织匀浆注射到小鼠肝脏的实验，发现注射坏死组织的部位出现 INTR 标记阳性细胞，而注射凝胶的部位则无此现象。在部分肝切除模型中，scRNA - seq 分析未发现具有 INTR 细胞特征的簇，免疫组化也未检测到 TP53INP1 阳性细胞，c - Jun 表达较弱且散在，表明 INTR 细胞在该模型中不存在，进一步证明与坏死组织接触是肝细胞转化为 INTR 细胞的必要条件。
7. INTR 细胞也出现在人类肝损伤中：对患有乙型肝炎病毒（HBV）、自身免疫性肝炎（AIH）和药物性肝损伤（DILI）的患者肝脏组织进行检测，发现 TP53INP1 或 c - Jun 阳性细胞出现在坏死区域周围，与小鼠实验结果相似，提示 INTR 细胞在人类肝损伤中同样存在。

研究讨论

1. 两类增殖细胞群体的发现及意义：本研究发现肝再生过程中存在两类不同的增殖细胞群体，这与以往研究中关于肝再生细胞增殖的普遍性但异质性不明确的结果相呼应。INTR 细胞由坏死组织接触诱导产生，具有高增殖能力和去分化特征，其出现丰富了对肝脏再生细胞来源和机制的认识。
2. INTR 细胞与其他肝干细胞 / 祖细胞的区别：INTR 细胞与以往报道的肝干细胞 / 祖细胞不同，虽然它表达肝细胞标记物，具有高增殖能力且表达一些干细胞相关基因，但不表达胆管细胞标记物，可塑性相对有限。这表明 INTR 细胞可能是一种独特的参与肝再生的细胞群体。
3. INTR 细胞的调控机制：INTR 细胞受到多种信号通路的调控，如 ErbB、MAPK、JAK - STAT 等，同时也涉及一些表观遗传机制，如长链非编码 RNA Malat1 的上调。此外，INTR 细胞表达 ANXA2，且可能发生 EMT 样变化，这些复杂的调控机制共同影响着 INTR 细胞的功能和行为。
4. 簇 0/1/8 细胞的特点及作用：簇 0/1/8 由高度分化的细胞组成，同时具有代谢活跃和增殖的特性。尽管其增殖可能面临代谢限制和潜在的基因组不稳定性，但在肝再生中可能发挥着重要作用，不过具体机制仍有待进一步研究。
5. INTR 和非 INTR 细胞的细胞周期差异：INTR 和非 INTR 细胞在细胞周期进展速率上存在显著差异，INTR 细胞增殖能力更强。mTOR 抑制可使非 INTR 细胞通过激活 c - Jun 加速 DNA 复制，这提示非 INTR 细胞可能在正常情况下主动调节细胞周期，而 INTR 细胞在肝再生中承担着快速补充受损肝细胞的重要任务。
6. 坏死组织在肝再生中的作用：坏死组织在诱导肝细胞转化为 INTR 细胞中起关键作用，直接接触坏死组织是细胞转化的必要条件。虽然具体的诱导分子尚未明确，但损伤相关分子模式（DAMPs）可能参与其中，这为进一步研究肝再生机制提供了重要方向。
7. 研究的局限性与展望：本研究虽然取得了重要发现，但仍存在一些局限性。例如，INTR 和非 INTR 细胞的主调控因子尚未明确，坏死组织诱导 INTR 细胞的具体分子未确定，且未进行谱系追踪以明确 INTR 细胞的动态变化。此外，非实质肝细胞对 INTR / 非 INTR 细胞转化和增殖的影响也未涉及，且研究主要在小鼠模型中进行，其结果对人类的适用性还需进一步研究。未来需要针对这些问题开展深入研究，以推动对肝再生机制的理解和肝病治疗策略的发展。