Borreliaceae家族水平泛基因组特征解析及附加体分型新策略开发

这篇研究通过全基因组测序(WGS)和泛基因组分析，揭示了引起莱姆病(Lyme disease)和回归热(relapsing fever)的Borreliaceae家族细菌应划分为Borrelia和Borreliella两个属。研究建立了基于基因内容的附加体(episome)分型系统，为开发精准诊断方法提供了新靶点，解决了传统分子诊断(MDx)因基因组异质性导致的灵敏度不足问题。

　　

Borreliaceae家族基因组特征解析

ABSTRACT
Borreliaceae家族包含多种专性寄生细菌，与莱姆病和回归热等人畜共患病密切相关。这类病原体检测困难，分子诊断(MDx)也因基因组异质性和深部组织定植特性导致灵敏度不足。研究通过构建家族水平泛基因组，揭示了其复杂生命周期相关的复制子(replicon)异质性，支持将原Borrelia属拆分为Borrelia（回归热病原体）和Borreliella（莱姆病病原体）两个属的分类方案。

IMPORTANCE
全基因组测序证实蜱传病原体存在属级分化，通过解析其非典型基因组结构开发的遗传分型系统，为疾病机制研究和医疗干预提供了新靶点。

INTRODUCTION
分布式基因组假说(distributed genome hypothesis)推动了细菌物种水平泛基因组研究，但针对螺旋体目(Spirochaetales)尤其是Borreliaceae家族的研究较少。该家族具有独特的线性染色体和多重附加体结构（常≥20个），其中小附加体因抗原变异相关基因的存在而高度可变。气候变迁导致其地理分布扩大，但关于其真实分类地位的争议持续存在——2016年提出的属级拆分方案（基于平均核苷酸相似性ANI）受到部分学者质疑。

RESULTS

Study design
研究整合了NCBI中69个高质量Borreliaceae基因组和39个新测序的环状共识测序(CCS)基因组，共108株菌株构建泛基因组。通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)验证复制子数量，采用Pacific Biosciences Sequel I平台进行单分子纠错测序。

Pacific biosciences sequel I全基因组测序验证
对比实验室测序的Borreliella burgdorferi B31d和Borrelia hermsii HS1d与公开参考基因组，发现线性质粒末端存在因发夹结构(hairpin ends)产生的测序假象。通过D-Genies比对和ResT Box 3 TATA基序鉴定，建立了线性复制子末端的标准化处理方法。

Average nucleotide identity (ANI)分析支持Borreliaceae二分法
基于pyani的ANI blast分析显示：

1. Borreliella属内菌株ANI>96%，但B. bavariensis部分菌株与B. garinii聚类
2. Borrelia属中，B. miyamotoi菌株ANI达97%，而爬行动物相关分离株B_sp_FGy1仅与B. turcica有94%相似性
3. 单拷贝核心基因系统发育树证实两属分化，未分类分离株B_sp_HM_thM16w与B. recurrentis最近

Borreliaceae家族水平泛基因组
在75% BlastP阈值下：

• 核心基因322个（家族水平仅488个）
• 壳基因1,352个
• 云基因3,424个
  EggNOG分析显示997个独特基因，反映算法差异。泛基因组增长曲线表明该家族基因组仍呈开放状态。

Borreliaceae附加体的基因内容分型
对1,800个复制子的Hadamard矩阵分析显示：

1. Borreliella中染色体、cp26和lp54高度保守
2. 临床相关的cp32质粒呈现极端异质性
3. Borrelia大线性质粒存在种特异性聚类
4. 爬行动物相关菌株复制子差异最大

DISCUSSION
研究通过多组学数据解决了Borreliaceae分类争议，ANI分析（11,556组比较）明确支持属级拆分。建立的基因内容分型系统克服了传统基于PFam32蛋白分型的局限性，特别适用于高度可变的cp32家族质粒。发现的PacBio测序假象处理方案可推广至其他含发夹末端的基因组研究。

Conclusions
研究证实Borreliaceae至少包含两个属，开发的复制子分型系统揭示了宿主互作基因的极端等位基因异质性，反映了这类病原体广泛的宿主适应能力。未来需更多基因组数据验证爬行动物相关菌株是否代表新属。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：

1. 改良BioNano插块法制备DNA
2. PacBio SMRTbell文库构建与Sequel I测序
3. pbcromwell流程进行基因组组装
4. Prokka注释结合Roary（BlastP 75%）和EggNOG泛基因组分析
5. MAFFT对齐和RAxML建树
6. pyani计算ANI与Hadamard矩阵可视化