解析新型海洋耐多胁迫酵母库德里阿兹威毕赤酵母 HJ2 氨转化机制：多组学联合分析揭示其在水产养殖中的重要意义

本文聚焦库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）HJ2，通过单因素、正交实验及多组学技术，探究其氨氮去除效率及机制。发现 HJ2 能高效去除氨氮，主要通过激活三羧酸（TCA）循环等途径。该研究为水产养殖氨氮污染治理提供新思路。

　　

引言

在水产养殖环境中，氨氮对水生动物构成严重威胁，其可穿透细胞膜，干扰水生动物氨基酸（AA）代谢，引发氧化应激、免疫抑制甚至导致死亡 。同时，过量氨氮还会致使浮游生物爆发性生长，破坏水生生态结构。因此，氨氮去除成为水产养殖、污水处理等领域的研究热点。

目前，物理、化学和生物方法均被用于去除氨氮。然而，物理和化学方法成本高昂且存在生态毒性风险。微生物技术因具有环保、可持续等优势，受到广泛关注。多种细菌和真菌已被证实具有氨氮去除能力，如Methanothermobacter sp. DTU779、Bacillus velezensis LG37 等细菌，以及Saccharomyces cerevisiae、P. kudriavzevii GW1 等真菌。

微生物去除氨氮的策略多样，包括铵转运、氨氧化和同化途径。其中，谷氨酸脱氢酶（GDH）或谷氨酰胺合成酶 - 谷氨酸合酶（GS/GOGAT）系统在氨同化过程中发挥重要作用。此外，氨转运蛋白 Mep1 和 Mep2 在细菌和真菌吸收 NH₄⁺过程中也具有关键作用。但在P. kudriavzevii中，氨转运的相关研究较少。

P. kudriavzevii具有去除氨氮和产酸的能力，但该菌种氨氮去除效率的相关报道较少。本研究以从亚热带海洋红树林环境中分离出的P. kudriavzevii HJ2 为研究对象，通过单因素和正交优化实验，探究其氨氮去除效率，并借助转录组和代谢组分析，深入解析氨氮转化机制，同时通过酶活性测试和过表达菌株构建，验证氨同化途径，旨在为水产养殖氨氮废水处理提供科学依据。

结果

HJ2 去除氨氮的理化及形态特征

• 单因素实验和正交试验：HJ2 在不同氨氮浓度、温度、接种浓度、pH 值、碳氮比（C/N）和碳源条件下培养，结果显示，氨氮浓度为 100 - 300mg/L 时，24h 内氨氮去除效率可达 100%；35°C 时，氨氮转化能力最强，去除效率达 74.78%；接种浓度在 0.5% - 1.5% 时，去除效率较高；HJ2 在 pH 3.0 - 9.0 范围内对氨氮去除能力较强；C/N 为 15 时，最适宜氨氮去除；以单糖（葡萄糖和果糖）为碳源时，氨氮去除效率最高。正交优化分析表明，培养时间对氨氮去除效率影响最大，其次是培养温度，接种浓度影响相对较小。在 35°C、接种浓度 0.5%、培养 36h 的条件下，HJ2 对 600mg/L 氨氮的去除效率可达 73.56%。
• HJ2 去除氨氮的生长形态分析：HJ2 在对照组和处理组的生长曲线显示，其对数生长期为 5 - 18h，处理组的最大 OD₆₀₀值（1.45）显著高于对照组（0.62）。扫描电子显微镜观察发现，处理组细胞明显大于对照组，且发芽率更高，表明 HJ2 在高氨氮条件下生长迅速，繁殖能力增强。
• 氨氮处理下 HJ2 细胞内总氨基酸含量：处理组 HJ2 湿细胞内总氨基酸含量随时间下降，但均显著高于对照组。这表明 HJ2 在去除氨氮过程中，将细胞外氨氮同化为细胞内氨基酸，这些氨基酸可作为蛋白质和其他大分子生物合成的前体。

P. kudriavzevii HJ2 氨氮转化机制的转录组分析

• 差异表达基因、功能注释分析和 RT-qPCR：转录组分析显示，对照组和处理组之间存在 1108 个差异表达基因（DEGs），其中 541 个上调，567 个下调。KEGG 通路富集分析表明，上调基因主要富集在碳代谢、氨基酸生物合成和氧化磷酸化等途径；下调基因则主要富集在 ABC 转运蛋白途径、脂肪酸降解和自噬等途径。通过 RT-qPCR 对 7 个 DEGs 进行验证，结果证实了转录组数据的可靠性。
• 转录组分析 HJ2 氨氮去除的转化机制：氨氮处理使 HJ2 中与糖酵解途径和 TCA 循环相关的基因上调，促进了乙酰辅酶 A 等 TCA 循环前体的生成，同时 TCA 循环的增强有助于有机酸和氨基酸代谢前体的合成。氨基酸代谢相关基因的上调，增加了 L - 谷氨酸、谷氨酰胺和 L - 天冬氨酸等氨基酸的合成。此外，核苷酸代谢和氧化磷酸化相关基因的上调，为细胞生长和繁殖提供了必要的物质和能量支持。同时，高浓度氨氮条件下，铵转运蛋白基因和氮调节相关基因下调，表明细胞内谷氨酰胺水平较高。

HJ2 的代谢组分析

• 氨氮处理下的代谢物分析：通过主成分分析（PCA）和代谢物差异分析，共鉴定出 520 个差异代谢物（DMs），其中 383 个上调，137 个下调。上调代谢物主要富集在有机酸及其衍生物、肽和氨基酸等类别，KEGG 富集分析显示，氨基酸代谢和核苷酸代谢途径显著富集。此外，上调的含氮代谢物比例较高，表明氨氮被转化为含氮代谢物。
• HPLC 分析代谢物：代谢组分析检测到 HJ2 在氨氮处理下产生多种游离氨基酸，其中 L - 谷氨酸浓度最高。HPLC 分析进一步证实，氨氮处理后，L - 谷氨酸、L - 天冬氨酸和 L - 鸟氨酸含量显著增加，且 L - 谷氨酸含量在 36h 时远高于其他两种氨基酸。此外，多种氨基酸衍生物的丰度也有所增加，这些衍生物具有多种生理功能，如调节免疫、抗氧化等。

HJ2 氨氮去除的转化机制

综合转录组和代谢组分析，HJ2 在氨氮处理下，通过上调氧化磷酸化代谢相关的 ATP 合酶基因，维持细胞生理活动。氨氮通过铵转运蛋白进入细胞后，参与多种氨同化酶催化的代谢过程。在精氨酸代谢途径中，谷氨酸作为前体，经一系列酶促反应生成 L - 鸟氨酸等物质，进入尿素循环。同时，天冬氨酸等物质参与嘧啶代谢，为细胞生长提供遗传物质。氨基酸代谢在 HJ2 氨氮去除过程中发挥关键作用，尿素循环也起到辅助转化作用。

氨同化酶活性测试和过表达菌株的构建

氨氮处理下，HJ2 中 GDH 和 GOT 的活性显著增加，而 GS 和 AS 的活性无明显差异，GOGAT 的活性在对照组中更高。过表达GOT1基因的菌株 HJ2/pGAPZAGOT1，其氨氮去除能力和 GOT 活性均显著增强，且生长速率优于野生型和对照组菌株。

添加外源氨基酸对 HJ2 氨氮去除特性和生长的影响

添加不同浓度的外源氨基酸（L - 谷氨酸、L - 天冬氨酸、L - 丙氨酸和 L - 鸟氨酸）后，发现氨基酸对 HJ2 的生长和氨氮去除效率有不同影响。低浓度的 L - 丙氨酸可促进 HJ2 生长，而高浓度的氨基酸会抑制其生长和氨氮去除能力。这可能是由于外源氨基酸对细胞内氨同化酶产生负反馈抑制，限制了 HJ2 从环境中合成含氮化合物的能力。

讨论

氨氮是严重的水体污染物，对水生动物和生态环境危害极大，利用微生物去除氨氮是有效方法。P. kudriavzevii HJ2 具有多种优良特性，如在模拟胃肠液中存活率高、具有抗氧化活性等，且其氨氮去除能力突出，在多种环境条件下都能高效去除氨氮，具有潜在的商业应用价值。

与其他微生物相比，HJ2 的氨氮去除能力在某些方面表现更优，且安全性已得到评估。通过多组学技术分析发现，HJ2 在氨氮处理下，基因表达和代谢物水平发生变化，促进了细胞内大分子的合成和生长繁殖。同时，氨同化酶活性的变化以及外源氨基酸的实验结果，都表明氨基酸代谢在氨氮去除过程中至关重要。

与其他氨氮去除微生物的机制不同，HJ2 主要通过氨同化途径去除氨氮，未来可进一步研究其硝化能力。本研究综合多种实验方法，深入解析了 HJ2 的氨氮去除机制，为水产养殖氨氮污染治理提供了理论支持和潜在解决方案。

材料与方法

• 菌株、试剂和培养基：P. kudriavzevii HJ2 分离自中国南海北部湾亚热带海洋红树林，使用多种分析纯试剂。YPD 培养基用于菌株活化，氨氮（AN）培养基用于实验研究，培养基中添加不同成分以设置不同实验条件。
• HJ2 的理化特性和氨氮去除：将 HJ2 在 YPD 琼脂平板上活化后，接种到 AN 培养基中，在不同氨氮浓度、温度、接种浓度、pH 值、C/N 和碳源条件下培养，测量细胞生长指数 OD₆₀₀。通过单因素实验确定各因素对氨氮去除效率的影响，并进行正交实验优化 600mg/L 氨氮条件下的去除效率。同时，测定 HJ2 在 0 和 600mg/L 氨氮浓度下的生长曲线，并通过扫描电子显微镜观察细胞形态。
• 氨氮处理下P. kudriavzevii HJ2 细胞内总 AA 含量：将 HJ2 在不同氨氮浓度下培养，收集不同时间点的酵母溶液，离心收集酵母沉淀，使用 AA 检测试剂盒测定总氨基酸含量。
• 分析方法：通过离心收集 HJ2 发酵液上清液，使用氮氨水杨酸 TNT 试剂盒和 DR900 多参数便携式比色计测定氨氮浓度，用 pH 计测量 pH 值，通过比浊法检测 OD₆₀₀值。
• HJ2 的转录组分析：将 HJ2 在 0 和 600mg/L 氨氮浓度下培养 12h，提取总 RNA，进行文库构建和测序。对原始数据进行过滤处理后，使用多种软件进行转录本组装、注释和差异表达分析，通过 GO 和 KEGG 通路富集分析研究 DEGs 的功能。
• HJ2 的代谢组分析：收集 HJ2 在 0 和 600mg/L 氨氮处理 24h 后的发酵上清液，进行代谢物分析。样品经处理后，使用 LC - MS/MS 系统进行检测，通过相关软件和数据库进行定性和定量分析，利用 PCA 和单变量分析筛选 DMs，并进行 KEGG 通路富集分析。
• 转录组和代谢组的共表达网络分析：使用 Pearson 相关系数在 R 语言 mixOmics 包中进行相关性分析，计算 DEGs 和 DMs 的相关系数 R²和 P 值，并将所有基因和代谢物映射到 KEGG 数据库进行统计分析。
• DEGs 和 DMs 的 RT - qPCR 和 HPLC 验证：根据转录组和代谢组联合分析结果，选择 7 个 DEGs 和 3 个 DMs 进行 RT - qPCR 分析和 HPLC 验证。提取 HJ2 总 RNA 并合成 cDNA，进行 RT - qPCR 反应。同时，使用 HPLC 预柱衍生化法测定氨基酸（L - 谷氨酸、L - 鸟氨酸和 L - 天冬氨酸）浓度。
• 氨同化酶活性测试：将 0.5% 种子液接种到不同氨氮浓度的培养基中，培养后收集细胞沉淀，提取酵母总蛋白并测定浓度。使用相应的试剂盒检测氨同化酶（GDH、GS、GOGAT、GOT 和 AS）的活性。
• 过表达菌株 HJ2/pGAPZAGOT1 的构建：以商业质粒 pGAPZA 为基础，构建整合表达载体 pGAPZAGOT1，通过电穿孔法将其导入P. kudriavzevii HJ2 中，筛选得到过表达菌株 HJ2/pGAPZAGOT1，同时构建空载体对照菌株 HJ2/pGAPZA_pGAP。
• 添加外源氨基酸对P. kudriavzevii HJ2 氨氮去除特性和生长的影响：制备不同氨基酸的储备液，添加到氨氮培养基中，设置不同浓度梯度。在 35°C、200rpm 条件下培养 HJ2，测量其生长指数 OD₆₀₀，并检测上清液中氨氮浓度。
• 统计分析：所有数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，使用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据处理和统计分析，通过 t 检验和单因素方差分析（ANOVA）评估差异显著性，用小写字母或星号表示差异程度。