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本文利用常压室温等离子体诱变（ARTP）和全基因组重测序技术，对荧光假单胞菌 PF08 生物膜调控基因进行全基因组筛选。发现 3 个编码 GGDEF-EAL 结构域蛋白的基因影响生物膜形成，为揭示其生物膜调控机制及保障食品安全提供新视角。
研究背景
生物膜由附着在各种表面的微生物细胞聚集而成，被胞外聚合物（EPS）包裹。其成分复杂，赋予生物膜强大的抗逆性，在食品工业中会威胁食品质量与安全。荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是重要的食品腐败菌，能在低温下生长，广泛存在于各类食品中，其形成的生物膜对食品危害极大。虽然已对部分荧光假单胞菌生物膜形成机制有所研究，但针对腐败菌株如 PF08 的生物膜形成策略仍不明确。传统筛选生物膜形成相关基因的方法繁琐耗时，而 ARTP 诱变结合全基因组重测序（WGR）技术为高通量筛选潜在生物膜调控基因提供了新途径。
材料与方法
- 菌株、质粒和培养条件：实验选用多种菌株和质粒，大肠杆菌（Escherichia coli）在 37°C 的 LB 肉汤中培养，荧光假单胞菌在 28°C 培养，必要时添加特定化学物质。
- ARTP 诱变：使用无锡某公司的 ARTP 诱变仪构建突变文库，将 PF08 菌液均匀涂在无菌铜片上，设置特定参数进行诱变，处理后的细胞用于生物膜培养。
- 全基因组重测序：培养突变文库细胞，分别收集游离细胞和生物膜细胞，提取 DNA。构建测序文库后进行 Illumina NovaSeq 6000 测序，分析测序结果，检测各类突变。
- 基因敲除突变体构建：按照特定方法构建目标基因的敲除突变体，通过一系列筛选和鉴定获得突变菌株。
- 多种实验测定：包括生长曲线测定、c-di-GMP 定量、生物膜定量、扫描电子显微镜（SEM）观察、铁载体定量、刚果红试验、运动性试验、自聚集试验、细胞疏水性试验、RNA 测序及数据评估、qRT-PCR 和统计分析等，以研究各基因功能及相关生理过程。
研究结果
- 高通量筛选策略：通过比较游离细胞和生物膜细胞基因组突变频率，发现两者突变谱差异显著，突变文库多样性高，覆盖度广，为筛选生物膜形成相关基因奠定基础。
- 相关基因鉴定：筛选出一组与生物膜形成密切相关的候选基因，其中 3 个编码 GGDEF-EAL 结构域蛋白的基因（D7M10_RS02105、D7M10_RS27690和D7M10_RS25705）在生物膜细胞和游离细胞中突变模式不同，可能参与生物膜形成调控。
- c-di-GMP 水平变化：构建这 3 个基因的敲除突变体，发现D7M10_RS27690和D7M10_RS02105突变体中 c-di-GMP 水平显著升高，表明它们主要具有磷酸二酯酶（PDE）活性，可降解 c-di-GMP；D7M10_RS25705对 c-di-GMP 水平无明显影响。
- 生物膜形成差异：D7M10_RS27690和D7M10_RS02105突变体在培养 12 小时和 24 小时后，生物膜形成量显著高于野生型，SEM 观察显示D7M10_RS27690突变体生物膜结构更复杂，细胞聚集度更高。
- 相关生理过程变化：D7M10_RS27690和D7M10_RS02105突变体促进铁载体和胞外多糖产生，降低细胞运动性，增强自聚集能力；D7M10_RS25705突变体则抑制铁载体产生，提高细胞运动性。三者对细胞疏水性均无明显影响。
- 转录组分析：对野生型和D7M10_RS27690突变体进行 RNA 测序，发现差异表达基因（DEGs），KEGG 富集分析表明，下调基因主要集中在鞭毛组装途径，上调基因主要在肽聚糖生物合成途径。qRT-PCR 验证了部分下调基因的表达变化。
讨论
本研究利用 ARTP 诱变结合 WGR 技术，筛选出荧光假单胞菌 PF08 生物膜形成相关基因，为深入研究其生物膜形成机制提供了方向。其中，D7M10_RS02105、D7M10_RS27690和D7M10_RS25705编码的蛋白参与 c-di-GMP 代谢，影响生物膜形成。c-di-GMP 通过调控多种生理过程，如胞外多糖产生、细胞运动性、自聚集和铁载体合成等，促进生物膜形成。此外，转录组分析揭示了相关基因表达变化，为进一步理解生物膜形成机制提供了依据。本研究为抑制荧光假单胞菌 PF08 生物膜形成、预防食品腐败提供了潜在靶点，研究策略也可应用于其他微生物生物膜形成基因的筛选。
