H9N2禽流感病毒在鸡、小鼠和雪貂体内传代过程中的准种适应性选择机制及其跨种传播潜能研究

这篇研究通过构建H9N2禽流感病毒（AIV）HA基因随机突变库，结合体内传代实验（鸡、小鼠、雪貂）和受体结合特性分析，揭示了病毒准种（quasispecies）在宿主适应过程中受唾液酸受体（Siaα2,3/Siaα2,6）分布驱动的选择规律。研究发现ΔL226/R229I突变增强小鼠致病性并引发细胞因子风暴（CRS），而N289D突变促进雪貂适应性，K412R/T480A突变则提升环境稳定性。该研究为AIV跨种传播机制提供了关键分子靶点。

　　

ABSTRACT
禽流感病毒（AIV）的跨种传播对公共卫生构成持续威胁，其中受体结合偏好从Siaα2,3向Siaα2,6的转变是关键限制因素。本研究通过构建H9N2病毒HA基因随机突变库，系统解析了病毒在鸡、小鼠和雪貂体内传代过程中的准种选择动态。

INTRODUCTION
H9N2作为低致病性AIV，因其广泛的宿主范围和持续进化能力成为潜在的大流行威胁。研究聚焦HA蛋白在受体结合特异性（如Q226L/G228S等经典突变）和环境适应性中的作用，通过随机突变谱揭示宿主适应的分子机制。

RESULTS

随机突变扫描揭示HA功能热点
通过PCR随机诱变构建的病毒库平均含8.7个HA核苷酸突变，其中66.9%为错义突变。体外筛选显示：

• K412R/T480A组合突变株经Siaα2,6-TRBCs筛选后占比75.6%，显著增强对人型受体的亲和力（P<0.001）
• ΔL226/R229I双突变株在Siaα2,3-TRBCs中占比73.5%，维持禽型受体偏好，但单突变（ΔL226或R229I）反而转向人型结合，提示突变间存在上位效应

环境耐受性突变筛选
热稳定性实验（50°C处理2小时）中K412R/T480A突变株占比从16.1%升至50.1%，其病毒滴度较野生型（HY）高1-2 log₁₀。酸耐受实验（pH 5.5-7.0）中该突变株存活率提升10倍，E439K突变则在极端酸性（pH 5.5）下占优（22.2%）。

宿主特异性选择模式

• 鸡模型：野生型HY（偏好Siaα2,3）占75.6%-77.0%，反映其已高度适应禽类宿主
• 小鼠模型：ΔL226/R229I突变株在传代中占比从14.0%升至51.5%，其感染导致：
  • 3 dpi时TNF-α水平降低（P<0.05）促进病毒复制
  • 5 dpi时IL-6/IL-1β激增引发细胞因子释放综合征（CRS），致死率100%
  • RNA-seq显示IL-17/TNF信号通路基因（如CXCL10、Saa3）显著上调
• 雪貂模型：N289D突变株（偏好Siaα2,6）在P4-P5代占比超64.4%，印证其与人型受体分布的兼容性

DISCUSSION
研究首次揭示ΔL226/R229I双突变通过协同作用维持Siaα2,3偏好，而单突变则引发表型转换。K412R/T480A突变同时增强受体结合与环境稳定性，提示其大流行潜力。值得注意的是，小鼠适应株通过抑制早期TNF-α逃逸免疫清除，后期则过度激活IL-17通路导致免疫病理损伤，为AIV致病机制提供新见解。

MATERIALS AND METHODS
关键技术包括：

1. 基于PacBio Sequel平台的第三代测序（平均49,309 reads/样本）
2. 定向进化实验（5代体内传代）
3. 固相结合法检测受体亲和力（Neu5Acα2-3Gal/α2-6Gal-biotin）
4. C57BL/6小鼠模型中的转录组分析（edgeR算法筛选DEGs）

该研究系统阐明了H9N2准种在跨物种屏障过程中的动态适应规律，为预警潜在人畜共患病风险提供分子标志。