施马伦贝格病毒非结构蛋白 NSs 和 NSm 对库蠓实验感染非必需：揭示病毒传播与变异奥秘

本文研究施马伦贝格病毒（SBV）。通过用含不同 SBV 毒株的血液喂食库蠓（Culicoides sonorensis），发现非结构蛋白 NSs 和 NSm 缺失不影响病毒在库蠓中的复制，而来自畸形胎儿的毒株 D281/12 无法在库蠓中复制，这对理解病毒传播意义重大。

　　

引言

施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus，SBV）是近年来备受关注的新兴病原体，对家畜尤其是牛羊等反刍动物危害极大。2011 年在德国 - 荷兰边境首次发现后，迅速在欧洲反刍动物群体中传播。急性感染通常症状不明显或仅伴有轻微的短暂临床症状，如发热、产奶量下降或短期腹泻等。但怀孕的反刍动物在妊娠关键期感染，会引发流产、死产或严重的胎儿畸形，即关节弯曲 - 积水性无脑综合征。

SBV 的传播依赖吸血昆虫媒介，主要是库蠓属（Culicoides）的叮咬蠓，蚊子已被排除作为其重要传播媒介。SBV 属于正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus），基因组由三条负链 RNA 片段组成。大（L）片段编码病毒 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp），对病毒 RNA 的转录和复制至关重要；小（S）片段编码核衣壳（N）蛋白和非结构蛋白 NSs，N 蛋白对包装病毒 RNA 和抵御宿主免疫防御很关键，NSs 是哺乳动物宿主中的主要毒力因子，但在昆虫载体中的作用尚不明确；中（M）片段编码糖蛋白 Gn、Gc 和非结构蛋白 NSm，NSm 在病毒生命周期中的功能大多未知，而 Gn 和 Gc 参与病毒进入宿主细胞的过程。

研究发现，SBV 在感染胎儿中的变异与在病毒血症动物或感染昆虫中的变异存在差异，胎儿来源的病毒变异体遗传多样性高，被认为是无法进一步传播的 “死端” 变异体，但缺乏在昆虫中复制特性的明确证据。本研究通过让库蠓口服感染不同的 SBV 变异体，探究其在昆虫体内的定植和复制特性。

材料和方法

1. 用于感染的病毒变异体：本研究使用了多种病毒变异体。SBV 菌株 BH80/11 - 4 分离自 2011 年一头病毒血症奶牛，D281/12 分离自畸形胎儿的大脑。D281/12 在三个基因组片段上都有多个点突变，M 片段还有大的基因组缺失。此外，还使用了基于 BH80/11 - 4 序列的重组病毒（rSBV），包括未修饰的 rSBV BH80/11 - 4 以及缺失 NSs（rSBV BH80/11 - 4 dNSs）、NSm（rSBV BH80/11 - 4 dNSm）或两者（rSBV BH80/11 - 4 dNSs/dNSm）的变异体。所有病毒变异体均在 BHK 细胞上培养，用于感染库蠓的病毒制剂浓度为 10⁶ 50% 组织培养感染剂量每毫升（TCID₅₀/mL）。
2. 库蠓的饲养：在德国弗里德里希 - 洛夫勒研究所的 BSL2 昆虫饲养室内，在标准化条件下饲养库蠓（Culicoides sonorensis）。饲养过程包括卵的收集、幼虫的发育、蛹的收集和成虫的培育。幼虫饲养在特定容器中，喂食磨碎的鱼食；蛹集中在海绵岛上收集；成虫饲养在垂直笼系统中，每周喂食三次温羊血，收集的卵用于维持种群。
3. 实验设计和样本处理：实验分为两个部分。在第一个实验中，用含有野生型病毒 BH80/11 - 4、D281/12 或重组病毒 rSBV BH80/11 - 4 的羊血喂食库蠓，同时设置未感染 SBV 的羊血作为阴性对照组。在喂食后不同时间点（0、4、6、8 天）对库蠓进行处理，部分库蠓整体检测，部分感染 BH80/11 - 4 的库蠓还分别对头部和身体进行检测，并对部分样本进行病毒分离验证。

在第二个实验中，用 rSBV 及其缺失突变体喂食库蠓，由于样本数量大，实验分为四个试验。根据第一个实验结果，只选择喂食后 0 天和 6 天两个时间点对库蠓进行 PCR 分析。实验中，每只库蠓单独提取总 RNA，进行基于 S 片段的实时荧光定量 PCR（RT - qPCR），部分样本还进行了测序以确认病毒基因组的缺失情况。
4. 统计分析：主要研究终点是在喂食后 4、6、8 天病毒复制的发生情况，通过精确的单侧二项式检验判断观察到的比例是否符合预期基准，再用双侧 Fisher 精确检验比较野生型 SBV 菌株 BH80/11 - 4 与不同病毒变异体组之间病毒复制比例的差异，P 值小于 0.05 表示具有统计学意义，统计分析使用 R 软件和 binom 包进行。

结果

1. 实验 1：来自病毒血症奶牛的野生型 SBV 在库蠓中复制，而来自畸形羔羊的病毒变异体则不能：用野生型 SBV 菌株 BH80/11 - 4 感染库蠓后，喂食后所有饱血库蠓立即检测 PCR 呈阳性。在后续时间点，部分库蠓检测到病毒复制，4 天时有 3.21%、6 天时有 2.07%、8 天时有 0.95% 的库蠓病毒载量高于喂食当天。重组病毒 rSBV BH80/11 - 4 感染库蠓后，6 天时有 6.25% 的库蠓病毒载量高于喂食当天，与野生型 BH80/11 - 4 在 6 天时有显著差异（P = 0.043）。对感染 BH80/11 - 4 的库蠓头部和身体单独分析发现，部分库蠓头部和 / 或身体检测到病毒，6 天时有 2.38% 的库蠓病毒载量超过 0 天感染组。

相比之下，病毒株 SBV D281/12 在库蠓中未检测到复制，喂食后虽所有饱血库蠓立即检测呈阳性，但后续时间点 RT - qPCR 结果均为阴性或病毒载量低于该感染组的临界值，与野生型 BH80/11 - 4 在 6 天时有显著差异（P = 0.018）。病毒分离实验也证实了 RT - qPCR 的结果。
2. 实验 2：SBV 非结构蛋白 NSs 和 NSm 对叮咬蠓中病毒复制特征无明显影响：为研究 SBV 非结构蛋白对病毒在库蠓中复制的作用，用缺失 NSs、NSm 或两者的病毒变异体感染库蠓。喂食后所有饱血库蠓立即检测 PCR 均呈阳性。6 天后，未修饰的 rSBV BH80/11 - 4 感染组中有 2.07% 的库蠓病毒载量高于喂食当天；rSBV BH80/11 - 4 dNSs 感染组中有 2.78%；rSBV BH80/11 - 4 dNSm 感染组中有 1.92%；rSBV BH80/11 - 4 dNSs/dNSm 感染组中有 1.55%。且各实验组与对照组之间病毒复制比例无显著差异，在高病毒基因组载量的库蠓中，通过测序确认了相应的 NSs 和 NSm 缺失。

讨论

本研究选择口服感染的方式模拟自然感染，相比胸内注射更能反映真实的病毒 - 载体相互作用情况。在解释实时 PCR 结果时，通过与喂食当天的库蠓病毒载量比较来判断病毒是否在昆虫体内复制。选择库蠓（C. sonorensis）作为实验对象，因其可在实验室饲养，常作为模型昆虫。

研究发现，SBV 的 NSs 蛋白对在库蠓中的病毒复制没有明显影响，NSm 蛋白的缺失也不影响感染和复制，这与使用相关病毒在细胞培养中的结果一致。但不同病毒在不同昆虫宿主中，NSs 和 NSm 蛋白的作用存在差异，其分子机制尚待进一步研究。

而来自畸形胎儿的病毒变异体 D281/12 在库蠓中不能复制，其基因组存在多个突变，尤其是 M 片段的大缺失。虽然具体是哪个突变导致其无法在库蠓中复制还需进一步研究，但这一结果支持了感染胎儿中产生的具有特征性基因组突变的 SBV 变异体无法进入正常昆虫 - 哺乳动物宿主循环，从而不能进一步传播的假设。未来还需要进行从载体物种到哺乳动物宿主的传播实验，以最终证明特定病毒变异体的载体能力。