HIV-1 转录起始位点突变体的 “逆袭” 之路：解析病毒适应性进化奥秘

本文聚焦 HIV-1 转录起始位点突变体，研究发现仅表达一种主要转录本的突变体（如 plusAC 病毒）存在复制适应性缺陷。在传代过程中，突变体通过多种突变方式产生多个回复突变体，恢复表达多种转录本，优先包装 1G RNA，提升复制能力，揭示了病毒适应进化机制。

　　

引言

HIV-1 属于逆转录病毒科，其生命周期独特。病毒将未剪接 RNA 包装进病毒粒子，感染靶细胞后，经逆转录酶（RT）作用，RNA 被转录为 DNA 并整合到宿主染色体，形成前病毒。HIV-1 DNA 两端有长末端重复序列（LTRs），而 RNA 的 5′端是 R-U5，3′端是 U3-R。在 DNA 合成时，RT 需通过两次链转移步骤重建 LTR。

宿主 RNA 聚合酶 II（Pol II）识别 HIV-1 位于 U3 的启动子，转录前病毒产生 HIV-1 RNA。部分转录本会进行复杂的可变剪接表达多种病毒基因，而未剪接的全长 HIV-1 RNA 兼具两种重要功能：作为 mRNA 翻译 Gag 和 Gag-Pol 多聚蛋白，同时作为病毒基因组将遗传信息传递给子代。

近年来研究发现，Pol II 会利用相邻序列作为转录起始位点，产生 5′端相差几个核苷酸（nts）的多种 HIV-1 RNA。其中，3G 和 1G RNA 是细胞中的两种主要转录本，二者虽仅相差两个鸟苷酸，但功能不同。1G RNA 更易被包装进病毒粒子作为基因组，而 3G RNA 翻译效率更高。

此前研究人员构建了两个 HIV-1 突变体：TTG 突变体主要表达 1G RNA，plusAC 突变体主要表达 3G RNA。这两个突变体虽能在 T 细胞中复制，但都存在复制适应性缺陷，这表明 HIV-1 通过表达多种具有特定功能的 RNA 来优化复制适应性。基于此，研究人员推测仅产生一种主要转录本的 HIV-1 突变体可能会通过适应来克服因单一 RNA 功能失衡导致的缺陷，于是开展了本研究，以探究 plusAC 病毒在 T 细胞传播感染过程中的适应性变化。

结果

1. NL4-3-plusAC 在 T 细胞中的传代实验：研究人员此前已证实，带有 2-nt 插入的 NL4-3-plusAC 主要表达 3G RNA，且复制动力学存在缺陷。为深入了解 HIV-1 转录起始和 RNA 功能的调控机制，他们进行了传代实验。实验中，研究人员从不同转染实验获得四种病毒储备液（NL4-3 和 NL4-3-plusAC），分别感染 Hut78/R5 细胞，并通过 p24 ELISA 监测 HIV-1 复制情况。结果发现，NL4-3 在大多数传代中于第 5 - 7 天达到病毒产生高峰，而 NL4-3-plusAC 在传代 1 中第 13 天达到高峰，传代 2 中在第 5 - 15 天，传代 3 中在第 7 天达到高峰。这表明 NL4-3-plusAC 在传代过程中复制动力学有所改善，暗示病毒发生了适应。
2. 基于 NGS 检测感染细胞中 U3-R 连接序列方法的开发：研究人员此前发现，CATA/TATA 盒与 R 区域起始的三个连续鸟苷酸之间的区域可调节 HIV-1 转录起始。为更好地了解病毒传代过程中的可能变化，他们开发了一种基于下一代测序（NGS）的检测方法，用于检测感染细胞中前病毒 U3-R 连接附近的序列。该方法利用定制的 NGS 引物池扩增前病毒 DNA 中包含 U3-R 连接的区域，在文库构建和 MiSeq 测序前添加 Illumina 索引。研究人员通过混合含有不同比例的三种细胞系（分别包含来自 NL4-3 - 基于载体 BH0、BH0-TTG 或 BH0-plusAC 的前病毒）的 DNA 样本进行验证，结果显示该方法产生的结果与样本中不同 DNA 物种的预期比例相符，从而验证了该检测方法的有效性。
3. 病毒传代过程中 U3-R 连接附近不同序列的检测：研究人员对传代过程中的 NL4-3 和 NL4-3-plusAC 病毒进行分析。在分析野生型 NL4-3 病毒时发现，在所有 12 个样本（三次传代，四个独立培养物）中，绝大多数病毒（>96%）在 U3-R 连接处以原始序列存在，仅鉴定出三种次要基因型。而在检测 NL4-3-plusAC 前病毒的 U3-R 连接时，发现其基因型高度多样化。在所有四个培养物中，NL4-3-plusAC 病毒在传代实验中迅速减少。实验中检测到多种变化，其中一种突变体（ac-GG）在所有四个培养物中均被检测到，且在部分培养物中成为主要基因型。不同培养物中出现了不同的优势突变体，这些突变体都包含 CATA/TATA 盒与 R 区域起始之间的缺失，纠正了 AC 二核苷酸插入，进一步支持了 CATA/TATA 盒与鸟苷酸之间的距离调节转录起始的观点。
4. NL4-3-plusAC 适应性突变体的特征：研究人员观察到在传代实验中成为优势病毒物种的四种 NL4-3-plusAC 适应性突变体：ac-GG、gAGG、dT-agGGG 和 del3-acGGG。为探究这些突变是否能改善病毒复制，他们构建了包含这些修饰的 NL4-3 - 基于突变分子克隆，感染 Hut78/R5 细胞并监测复制动力学。结果显示，所有四种适应性突变体的病毒产生高峰均在第 9 - 13 天，相比 NL4-3-plusAC 有所改善。

研究人员还利用 NGS - 基于的 5′ RACE 方法分析了感染细胞产生的细胞内 HIV-1 RNA 和病毒粒子 RNA 的 5′端，以了解这些突变如何改变 HIV-1 转录起始以及基因组包装偏好。结果发现，不同突变体转录起始位点不同，产生的 RNA 种类及在病毒粒子中的富集情况也不同，但所有突变体都产生多种主要转录本，且相比 plusAC 突变体，都显著增加了 1G RNA 的转录并优先包装 1G RNA，表型更接近野生型 NL4-3。
5. HIV-1 一轮复制中复制鸟苷酸帽的速率：在 NL4-3 和 NL4-3-plusAC 中，研究人员均检测到转录起始前的核苷酸转换为鸟苷酸的序列变化。他们推测这是由于 RT 在 DNA 合成过程中复制了 1G RNA 的鸟苷酸帽。为量化这种变化的频率，研究人员利用 BH0-TTG（一种表达功能性 Gag/Gag-Pol、Tat、Rev 和表面标记 HSA 的 NL4-3 - 基于载体，其 LTRs 中的三个连续鸟苷酸被改为 TTG）进行实验。通过比较一轮复制前后（P1 和 P2 病毒）的序列变化，研究人员发现位置 2 的鸟苷酸比例在一轮复制中有显著增加，经计算，T-to-G 替换在一轮复制中约发生 5% 的事件，该速率比病毒基因组其他位置的一般替换率至少高 1000 倍，进一步支持了 T-to-G 替换是由于 RT 复制鸟苷酸帽的假设。

讨论

HIV-1 产生的多种未剪接转录本在 5′端相差几个核苷酸，但功能不同。仅表达一种主要转录本的突变体存在复制适应性缺陷。在本研究中，NL4-3-plusAC 突变体在传代过程中产生多个回复突变体，这些回复突变体缩短了 CATA/TATA 盒与 R 区域起始之间的距离，恢复了表达多种主要转录本的能力，选择性包装 1G RNA，且复制动力学得到改善。这表明表达两种功能不同的未剪接 RNA 对 HIV-1 的最佳复制适应性至关重要。

研究发现，在包装功能方面，1G RNA 的功能较难被其他 RNA 物种替代，而翻译模板功能相对容易被替代，许多回复突变体使用其他 RNA 物种替代 3G RNA 的翻译功能。

通过 NGS 检测发现，U3-R 连接附近的序列频繁发生突变。在野生型 NL4-3 中，主要观察到三种变化，其中一种 T-to-G 替换可能是由于复制 3G RNA 的鸟苷酸帽导致。在 NL4-3-plusAC 病毒传代过程中，观察到更多种类的变化，包括多种 1 - 3-nt 缺失突变体。研究人员推测了这些突变体产生的可能机制，如 ac-GG 突变体可能是由于负链 DNA 转移过程中的错配，gAGG 突变体的产生可能涉及多个步骤等。

此外，研究人员还在人体样本中观察到 RT 复制鸟苷酸帽的现象，这表明该现象对 HIV-1 在人体内的复制有影响。同时，HIV-1 通过编码三个连续鸟苷酸，具有吸收这种频繁突变并维持遗传稳定性的内在机制。

材料和方法

1. HIV-1 构建体的分子克隆：研究使用的全长感染性分子克隆 pNL4-3 由 Malcom Martin（NIAID）馈赠，通过 NIH HIV 试剂计划获得。此前已构建了 NL4-3-TTG 和 NL4-3-plusAC 两个突变体，它们在 U3 和 R 区域的连接处有修饰。其他基于 NL4-3 的突变体通过用合成的含突变 DNA 片段替换 NL4-3 的 MluI - 到 - BssHII（5′ LTR）和 XhoI - 到 - NgoMIV（3′ LTR）片段获得。此外，还使用了包含 HIV-1 复制所需顺式作用元件的 NL4-3 - 基于载体 BH0 及其衍生物 BH0-TTG 和 BH0-plusAC，这些载体不表达 Env，在补充 VSV-G 包膜时可进行一轮复制。质粒构建使用 NEBuilder Gibson Assembly 试剂盒或标准分子克隆技术，并通过 Sanger 测序或纳米孔全基因组测序验证修饰区域。
2. 细胞培养、细胞系和病毒感染：人胚肾 293T 细胞和 Hut78/R5 细胞分别在特定培养基中培养并添加相应的补充剂，在 37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。使用 TransIT-LT1 转染 293T 细胞以产生病毒，收集病毒上清液并通过 p24 ELISA 定量。用特定量的病毒感染 Hut78/R5 细胞监测复制动力学，感染后定期收集样本进行分析。
3. RNA 和 DNA 的分离与分析：从培养上清液中提取病毒粒子 RNA，从感染细胞中分离总细胞 RNA 或总细胞 DNA。通过转染表达 VSV-G 的质粒激活 BH0-TTG 细胞系产生病毒，收集不同阶段的病毒并提取 RNA，经处理后进行 RT-PCR 扩增和 Sanger 测序，计算野生型和突变体序列的相对比例。使用实时 qPCR 测量总细胞 DNA 中前病毒的拷贝数。
4. 基于 NGS 的方法和分析：使用基于 NGS 的 5′ RACE 方法确定感染细胞和病毒粒子中 HIV-1 未剪接转录本的 5′端。通过设计特定引物扩增包含 U3 和 R 连接的片段，对 PCR 产物进行纯化、定量、索引后进行 MiSeq 测序，分析 U3 和 R 连接附近的序列。
5. 生物信息学和统计分析：使用自定义生物信息学流程分析 MiSeq NGS 读数，包括修剪接头、过滤质量、转换为 FASTA 文件等步骤，并用自定义 Python 脚本计数序列种类。使用 GraphPad Prism v9.2.0 进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

致谢

研究人员感谢 Eric Freed、Sherimay Alban、Alice Duchon 和 Jigui Shan 在研究过程中的帮助和支持。该研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）、美国国家癌症研究所（NCI）等机构的资助。