探秘 4 - 羟基 - 3 - 甲基 - 2 - 烯基喹啉：伯克霍尔德菌来源生物碱的抗生物膜奥秘与潜在价值

本文聚焦从土壤分离的伯克霍尔德菌（Burkholderia）MS14 菌株产生的 4 - 羟基 - 3 - 甲基 - 2 - 烯基喹啉（HMAQ-7）。研究发现其能抑制多种细菌生物膜合成，还影响芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的运动性和芽孢形成等，为微生物生态和抗菌研究提供新思路。

　　

引言

伯克霍尔德菌属包含多种细菌，部分可致病，部分具有植物生长促进作用。该属还是发现多种天然产物的重要来源，这些产物具有抗菌等多种活性。4 - 烷基喹诺酮（4AQs）是伯克霍尔德菌产生的一类代谢物，属于生物碱，具有多样的生物和药理特性，如抗菌、抗线虫和抗癌等。其结构具有模块化特点，在不同属中功能存在差异。此前对 4AQs 的研究存在局限，如分离和表征方法不佳，多为定性研究。本研究旨在鉴定伯克霍尔德菌污染种（Burkholderia contaminans）MS14 产生的一种分子，明确其结构和生物学功能。

结果

1. HMAQ-7 的分离与结构表征：在分离抗真菌化合物奥西迪芬（occidiofungin）时，从B. contaminans MS14 中发现一种对致病放线菌密歇根棒杆菌（Clavibacter michiganesis）有活性的未知代谢物。经结构分析，确定其为一种新型 HMAQ 生物碱，化学分子式为 C₁₇H₂₁NO，含有一个七碳反式烯基，命名为 HMAQ-7。通过高分辨率质谱（HRMS）、一维（1D）和二维（2D）核磁共振（NMR）等技术确定了其共价结构。
2. HMAQ-7 的 NMR 分析：1D NMR 光谱显示化合物含有芳香烃，H¹ NMR 检测到一个可交换酰胺质子和四个去屏蔽芳香质子，C¹³ NMR 确定了九个芳香碳，还显示存在一个七碳烷基链。2D HSQC 和 HMBC 数据证实了所有碳和质子的归属，确定了 HMAQ-7 的结构特征。
3. HMAQ-7 的液相色谱 - 高分辨率质谱（LC-HRMS）分析：对 HMAQ-7 进行串联质谱分析，除了检测到母体分子的质子化前体离子外，还鉴定出 11 个主要碎片离子。这些碎片离子的质量与 HMAQ-7 的结构裂解模式相符，为其共价结构和烯基的归属提供了进一步支持。
4. HMAQ-7 的抗菌活性：采用最低抑菌浓度（MIC）试验评估 HMAQ-7 对多种细菌和真菌的抑制活性。结果显示，HMAQ-7 未表现出低微摩尔抑制活性，对革兰氏阳性菌密歇根棒杆菌和霉菌黑曲霉（Aspergillus niger）的 MIC 分别为 31.3 μg/mL 和 62.5 μg/mL。但在低微摩尔浓度下，HMAQ-7 能诱导多种受试生物的宏观凝集表型发生变化，且该变化可能与细胞生理和行为改变有关，而非化合物毒性。
5. HMAQ-7 对溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）MW-01 的抗生物膜活性：HMAQ-7 对S. haemolyticus的最低有效浓度（MEC）为 7.8 μg/mL。在该浓度下，24 h 孵育后，S. haemolyticus在处理孔底部的生长聚集表型明显改变，生物膜形成减少。通过结晶紫染色和光密度测量（OD₆₀₀）进行定性和定量分析，结果表明 HMAQ-7 在低于 MEC 的浓度（3.9 μg/mL）时，就能显著抑制生物膜形成。
6. 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）对 HMAQ-7 暴露的表型响应：在 MIC/MEC 试验中，B. subtilis对 HMAQ-7 的 MEC 为 2 μg/mL，处理后其絮凝形态发生明显变化，且处理孔的浊度降低，但细胞密度和生长速率未受影响。进一步研究发现，HMAQ-7 能抑制B. subtilis的运动性、菌膜形成和芽孢形成。转录组分析表明，HMAQ-7 暴露导致B. subtilis中大量基因差异表达，涉及鞭毛、质膜、sigma 因子（SF）调控子、芽孢形成和转录因子（TF）调控子等多个功能类别。
7. 复杂生物膜暴露于 HMAQ-7 的情况：使用唾液来源的多物种生物膜模型，评估 HMAQ-7 对复杂生物膜的影响。结果显示，50 μg/mL 的 HMAQ-7 在预处理和后处理条件下，均能显著降低生物膜的覆盖率和厚度，效果与阳性对照肽抗生素乳链菌肽（nisin）相似，表明 HMAQ-7 不仅能抑制生物膜形成，还能减小现有生物膜的大小。

讨论

本研究对伯克霍尔德菌产生的 2 - 烷基 - 4 (1H)- 喹诺酮代谢物 HMAQ-7 的结构和微生物生理学效应进行了研究。HMAQ-7 对溶血葡萄球菌和唾液来源的多物种生物膜具有强大的抗生物膜特性，这对于治疗由溶血葡萄球菌引起的医院感染具有潜在意义。虽然 HMAQ-7 对多种受试生物的抑制活性有限，但它能诱导显著的表型变化。推测伯克霍尔德菌可能利用 HMAQ-7 防止基质形成和破坏已建立的生物膜，以促进自身在多种环境中的定植。HMAQ-7 的作用机制可能与干扰群体感应、外排泵或细胞外成分释放有关，也可能通过影响细胞膜相关过程发挥作用。目前尚未确定其具体细胞靶点，但数据支持其对细胞膜的影响。未来需通过代谢组学和蛋白质组学研究进一步阐明其生物学活性。本研究为后续研究 HMAQ-7 的作用机制、对伯克霍尔德菌毒力的影响以及在动物系统中破坏生物膜以减轻感染和疾病的能力奠定了基础。